Cuantificación en tiempo real de un conjunto de muestras colombianas de relevancia histórica mediante la detección de un fragmento corto de la región hipervariable II del ADN mitocondrial

Luz Adriana Pérez, Freddy Rodríguez, Carl Henrik Langebaek, Helena Groot

Resumen


Introducción. A diferencia de otro tipo de investigaciones, el análisis de ADN antiguo (ADNa) requiere la implementación de condiciones metodológicas y de infraestructura especializadas que garanticen la autenticidad de los resultados. Uno de los criterios de autenticidad para este tipo de muestras es la cuantificación del material genético, en la cual es común el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real, por su sensibilidad y especificidad. La implementación de estas metodologías y de las condiciones necesarias para el cumplimiento de los requisitos de autenticidad hace que este tipo de investigación sea dispendioso y costoso. Objetivo. Generar una estrategia de cuantificación del ADN mitocondrial de muestras seriamente degradadas mediante un sistema sencillo y de fácil implementación. Materiales y métodos. El sistema se basa en el uso de iniciadores que posibilitan la amplificación específica de fragmentos cortos del ADN mitocondrial. La posterior purificación de este fragmento permite generar una curva estándar con concentraciones acordes al estado de degradación de la muestra. Resultados. Se detectó ADN antiguo proveniente de restos óseos y tejidos momificados de diferentes fechas. Además, el sistema permitió detectar la presencia de agentes inhibidores del ADN. Conclusión. La implementación de la estrategia aquí planteada es sencilla, puede reducir los costos de la investigación y, además, permite la detección de ADNa en muestras muy degradadas, así como la discriminación entre las muestras que no poseen material genético y aquellas que presentan agentes inhibidores.


Palabras clave


ADN; ADN mitocondrial; reacción en cadena de la polimerasa

Texto completo:

PDF HTML

Referencias


1. Hagelberg E, Hofreiter M, Keyser C. Ancient DNA: The first three decades. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015;370:20130371. http://dx.doi.org/10.1098/rstb. 2013.0371.
2. Kaestle FA, Horsburgh A. Ancient DNA in anthropology: Methods, applications, and ethics. Yearb Phys Anthr. 2002;130:92-130.
3. Willerslev E, Cooper A. Ancient DNA. Proc Biol Sci. 2005;272:3-16. http://dx.doi.org/10.1098/rspb.2004.2813
4. Holliday R, Grigg GW. DNA methylation and mutation. Mutat Res. 1993;285:61-7. http://dx.doi.org/10.1016/0027-5107(93)90052-H
5. Höss M, Jaruga P, Zastawny TH, Dizdaroglu M, Pääbo S. DNA damage and DNA sequence retrieval from ancient tissues. Nucleic Acids Res. 1996;24:1304-7. http://dx.doi.org/10.1093/nar/24.7.1304
6. Gilbert MTP, Bandelt HJ, Hofreiter M, Barnes I. Assessing ancient DNA studies. Trends Ecol Evol. 2005;20:541-4. http://dx.doi.org/10.1016/j.tree.2005.07.005
7. Cooper A, Poinar H. Ancient DNA, do it right or not at all. Science. 2000;289:1139. http://dx.doi.org/10.1126/science. 289.5482.1139b
8. Krings M, Stone A, Schmitz RW, Krainitzki H, Stoneking M, Pääbo S. Neanderthal DNA sequences and the origin of modern humans. Cell. 1997;90:19-30. http://dx.doi.org/10. 1016/S0092-8674(00)80310-4
9. Gabriel MN, Huffine EF, Ryan JH, Holland M, Parsons T. Improved MtDNA sequence analysis of forensic remains using a “ mini-primer set ” amplification strategy. J Forensic Sci. 2001;46:247-53.
10. Bio-Rad Laboratories. SsoFastTM EvaGreen ® Supermix 200. Hercules, CA, USA: Bio-Rad Laboratories; 2014.
11. Butler J. Forensic DNA typing. Biology, technology, and genetics of STR markers. Second edition. Burlington, MA: Academic Press; 2005.
12. QIAGEN. QIAamp® DNA Investigator. Sample and Assay Technologies. Valencia, CA: QIAGEN; 2010.
13. Loreille OM, Diegoli TM, Irwin JA, Coble MD, Parsons TJ. High efficiency DNA extraction from bone by total demineralization. Forensic Sci Int Genet. 2007;1:191-5. http://dx.doi.org/10.1016/j.fsigen.2007.02.006
14. Thermo Fisher Scientific Inc. GeneJET Gel Extraction Kit. Waltham, MA, USA: Thermo Fisher Scientific Inc; 2012.
15. Alonso A, Albarrán C, Martín P, García P, García O, De la Rúa C, et al. Multiplex – PCR of short amplicons for mtDNA sequencing from ancient DNA. Int Congr Ser. 2003;1239:585-8. http://dx.doi.org/10.1016/S0531-5131(02) 00401-6
16. Kavlick MF, Lawrence HS, Merritt RT, Fisher C, Isenberg A, Robertson JM, et al. Quantification of human mitochondrial DNA using synthesized DNA standards. J Forensic Sci. 2011;56:1457-63. http://dx.doi.org/10.1111/j.1556-4029.2011.01871.x
17. Sprouse ML, Phillips NR, Kavlick MF, Roby RK. Internal validation of human mitochondrial DNA quantification using real-time PCR. J Forensic Sci. 2014;59:1049-56. http://dx. doi.org/10.1111/1556-4029.12477
18. Young H, Jin M, Young N, Eun J, Ick W, Shin K. Simple and highly effective DNA extraction methods from old skeletal remains using silica columns. Forensic Sci Int Genet; 2010;4:275-80. http://dx.doi.org/10.1016/j.fsigen. 2009.10.014
19. Yang DY, Eng B, Waye JS, Dudar JC, Saunders SR. Technical note: Improved DNA extraction from ancient bones using silica-based spin columns. Am J Phys Anthropol. 1998;105:539-43. http://dx.doi.org/10.1002/(SICI)1096-8644 (199804)105:4<539::AID-AJPA10>3.0.CO;2-1
20. Anderung C, Persson P, Bouwman A. Fishing for ancient DNA. Forensic Sci Int Genet. 2008;2:104-7. http://dx.doi.org/10.1016/j.fsigen.2007.09.004
21. Robin ED, Wong R. Mitochondrial DNA molecules and virtual number of mitochondria per cell in mammalian cells. J Cell Physiol. 1988;136:507-13. http://dx.doi.org/10.1002/jcp.1041360316
22. Stoneking M. Hypervariable sites in the mtDNA control region are mutational hotspots. Am J Hum Genet. 2000;67: 1029-32. http://dx.doi.org/10.1086/303092
23. Keyser-Tracqui C, Ludes B. Methods for the study of ancient DNA. Methods Mol Biol. 2005;297:253-64.
24. Lee SB, Mccord B, Buel E. Advances in forensic DNA quantification. Electrophoresis. 2014;35:3044-52. http://dx. doi.org/10.1002/elps.201400187
25. Nielsen K, Smidt H, Hedman J, Parson W, Morling N, Niedersta H. Comparison of five DNA quantification methods. 2008;2:226-30. http://dx.doi.org/10.1016/j.fsigen. 2008.02.008
26. Lamers R, Hayter S, Matheson CD. Postmortem miscoding lesions in sequence analysis of human ancient mitochondrial DNA. J Mol Evol. 2009;68:40-55. http://dx.doi.org/10.1007/s00239-008-9184-3
27. Gotherstrom A, Collins MJ, Angerbjorn A, Liden K. Bone preservation and DNA amplification. Archeometry. 2002;44:395-404. http://dx.doi.org/10.1111/1475-4754.00072
28. Handt O, Krings M, Ward RH, Pääbo S. The retrieval of ancient human DNA sequences. Am J Hum Genet. 1996;59:368-76.
29. Pérez LA, Groot H, Langebaek CH. Aportes genéticos para el entendimiento de la organización social de la comunidad muisca Tibanica (Soacha, Cundinamarca) (tesis). Bogotá: Universidad de los Andes; 2016.




DOI: https://doi.org/10.7705/biomedica.v36i3.3098

Métricas de artículo

Cargando métricas ...

Metrics powered by PLOS ALM




Revista Biomédica -  https://doi.org/10.7705/issn.0120-4157
ISSN 0120-4157

Instituto Nacional de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Avenida Calle 26 No. 51-20
Apartado aéreo 80334 y 80080
Bogotá, D.C., Colombia, S.A.
Teléfono: 05712207700 Ext. 1386
Correo electrónico: biomedica@ins.gov.co