Biomédica 2017;37:209-17

http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v37i3.3324

ARTÍCULO ORIGINAL

Diversidad genética de cepas extraintestinales de Escherichia coli productoras de las betalactamasas TEM, SHV y CTX-M asociadas a la atención en salud

Yasmin Varela1,2, Beatriz Millán1*, María Araque1

1 Laboratorio de Microbiología Molecular, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela

2 Posgrado de Microbiología Clínica, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela

Contribución de los autores:

Yasmin Varela y Beatriz Millán: caracterización fenotípica y molecular de las cepas estudiadas, análisis bioinformático

María Araque: diseño del estudio y discusión crítica

Todas las autoras participaron en la escritura del manuscrito

Recibido: 23/04/16; aceptado: 23/08/16


Introducción. En Venezuela existen pocos reportes que describan las bases genéticas del potencial patogénico y filogenético de las cepas de Escherichia coli provenientes de hospitales.

Objetivo. Determinar la diversidad genética de cepas extraintestinales de E. coli productoras de las betalactamasas TEM, SHV y CTX-M asociadas a la atención de salud.

Materiales y métodos. Se estudió una colección de 12 cepas extraintestinales de E. coli con sensibilidad disminuida a las cefalosporinas de amplio espectro. La sensibilidad antimicrobiana se determinó por concentración inhibitoria mínima. La detección de los grupos filogenéticos, de los factores de virulencia y de los genes que codifican la resistencia antimicrobiana se hizo mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa y la relación clonal se estableció mediante reacción en cadena de la polimerasa de elementos palindrómicos extragénicos repetitivos (Repetitive Element Palindromic-PCR, rep-PCR).

Resultados. Todas las cepas analizadas presentaron resistencia a las cefalosporinas, y resistencia conjunta a quinolonas y aminoglucósidos. La distribución filogenética evidenció que los grupos A y B1 fueron los más frecuentes, seguidos por D y B2; en este último, se detectaron todos los factores de virulencia evaluados, y el gen más frecuente fue el fimH. En todas las cepas analizadas, se encontró blaCTX-M, con predominio de las blaCTX-M-8, y en dos de estas cepas se evidenció la presencia simultánea de bla CTX-M-9, variantes bla CTX-M-65 y bla CTX-M-147

Conclusión. Las cepas estudiadas demostraron diversidad genética y albergaron diferentes genes de virulencia y betalactamasas de espectro extendido (BLEE) sin predominio de ningún filogrupo en particular. Este estudio constituye el primer reporte de la variante bla CTX-M-65 en Venezuela y de la variante blaCTX-M-147 en el mundo, en cepas no relacionadas genéticamente aisladas de hospitales, situación que merece atención y la racionalización del uso de los antimicrobianos.

Palabras clave: Escherichia coli; infección hospitalaria; betalactamasas; filogenia; reacción en cadena de la polimerasa. http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v37i3.3324


Genetic diversity of extraintestinal Escherichia coli strains producers of beta-lactamases TEM, SHV and CTX-M associated with healthcare

Introduction: There are few reports from Venezuela describing the genetic basis that sustains the pathogenic potential and phylogenetics of Escherichia coli extraintestinal strains isolated in health care units.

Objective: To establish the genetic diversity of extraintestinal E. coli strains producers of betalactamases TEM, SHV and CTX-M associated with healthcare.

Materials and methods: We studied a collection of 12 strains of extraintestinal E. coli with diminished sensitivity to broad-spectrum cephalosporins. Antimicrobial susceptibility was determined by minimum inhibitory concentration. We determined the phylogenetic groups, virulence factors and genes encoding antimicrobial resistance using PCR, and clonal characterization by repetitive element palindromic- PCR rep-PCR.

Results: All strains showed resistance to cephalosporins and joint resistance to quinolones and aminoglycosides. The phylogenetic distribution showed that the A and B1 groups were the most frequent, followed by D and B2. We found all the virulence factors analyzed in the B2 group, and fimH gene was the most frequent among them. We found blaCTX-M in all strains,with a higher prevalence of blaCTX-M-8 two of these strains showed coproduction of bla CTX-M-9 and were genetically identified as bla CTX-M-65 and bla CTX-M-147 by sequencing.

Conclusion: The strains under study showed genetic diversity, hosting a variety of virulence genes, as well as antimicrobial resistance with no particular phylogroup prevalence. This is the first report of bla CTX-M alleles in Venezuela and in the world associated to non-genetically related strains isolated in health care units, a situation that deserves attention, as well as the rationalization of antimicrobials use.

Key words: Escherichia coli; cross infection; beta-lactamases; phylogeny; clonal diversity; polymerase chain reaction.

http://dx.doi.org/10.7705/biomedica.v37i3.3324


Escherichia coli constituye parte de la microbiota habitual del intestino de muchos animales, incluidos los humanos. Según su relación con el huésped se agrupa en cepas comensales, patotipos intestinales y patógenas extraintestinales (Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli, ExPEC) (1). Este último grupo es la causa principal de infecciones urinarias, abdominales y de tejidos blandos, así como de meningitis, neumonía, bacteriemias y osteomielitis (2).

Las cepas de E. coli son genéticamente diversas y las diferencias entre las patógenas y las comensales se fundamentan en sus antecedentes filogenéticos, con base en los cuales se clasifican en cuatro grupos principales: A, B1, B2 y D (3). Las cepas A y B1 se consideran de bajo poder virulento, en tanto que las patógenas extraintestinales albergan genes que codifican factores de virulencia responsables de promover las etapas de colonización, adherencia, invasión y evasión de los mecanismos de defensa del huésped humano, y pertenecen principalmente a los filogrupos B2 y D (1,4,5).

Tradicionalmente, los antibióticos betalactámicos se han utilizado para el tratamiento de las infecciones producidas por E. coli. Sin embargo, en los últimos años su efectividad se ha visto amenazada por el incremento en la prevalencia de cepas productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) (6). La mayoría de las BLEE producidas por miembros de la familia Enterobacteriaceae son variantes alélicas de las conocidas betalactamasas TEM y SHV (7), pero desde los años 90, otras enzimas identificadas como CTX-M de la clase A de Ambler, se han diseminado rápidamente en todo el mundo (6).

La relación entre los genes que median la resistencia antimicrobiana, los grupos filogenéticos y la presencia de factores determinantes de virulencia como indicadores de patogenia es controversial (2,8). No obstante, Lee, et al. (9), encontraron una estrecha relación entre los genes involucrados en el transporte del hierro (iutA), la supervivencia en el suero (traT) y la presencia de CTX-M-1 y CTX- M-9 en aislamientos de E. coli extraintestinales del grupo B2.

En este contexto, recientemente se reportó por primera vez en Latinoamérica la presencia de cepas de E. coli uropatógenas productoras de CTX-M-15, filogrupo B2, provenientes de la comunidad, que portaban por lo menos cinco genes asociados a virulencia (fimH, kpsMTII, papAH, fyuA y usp), así como islas de patogenia (10). La diseminación mundial de la CTXM-15 y de clones patógenos, como el tipo ST131, parece responder a una eficiente plataforma genética de transferencia horizontal de genes de resistencia y virulencia mediante la inserción de secuencias genéticas específicas, transposones y plásmidos (11).

Las técnicas de genotipificación se han convertido en herramientas valiosas para el análisis de bacterias, especialmente, las involucradas en infecciones hospitalarias. Entre dichas técnicas se encuentra la amplificación de elementos repetitivos palindrómicos por PCR (repetitive element palindromic- PCR, rep-PCR), la cual tiene una gran capacidad de discriminación y puede emplearse para la detección rápida de la diversidad y la evolución de los genomas bacterianos (12).

En Venezuela son pocos los reportes que describen las bases genéticas que sustentan el potencial patogénico de los grupos filogenéticos y la relación clonal de E. coli extraintestinales (ExEC) productoras de BLEE asociadas a la atención en salud (13).

En este sentido, en el presente estudio se determinó la diversidad genética de cepas aisladas de pacientes recluidos en el Servicio de Medicina Interna del Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes (IAHULA) de Mérida, Venezuela.

Materiales y métodos

Cepas bacterianas

Se estudió una colección de 12 cepas extraintestinales de E. coli con sensibilidad disminuida a las cefalosporinas de amplio espectro, provenientes de aislamientos de adultos hospitalizados en el Servicio de Medicina Interna del IAHULA con infección asociada a la atención en salud, de marzo a julio de 2013.

La edad promedio de los pacientes incluidos en el estudio fue de 39,25 años (rango de 20 a 82) y la distribución de las cepas aisladas fue igual para ambos sexos. En cuatro casos, se diagnosticó neumonía adquirida en el hospital, en tres, infecciones de heridas no quirúrgicas, en dos, infección de las vías urinarias, y en cada uno de los tres casos restantes, sepsis, absceso e infección de la herida quirúrgica, respectivamente. Los aislamientos habían sido caracterizados parcialmente en un estudio previo (14).

Prueba de sensibilidad antimicrobiana

La sensibilidad antimicrobiana se determinó con la concentración inhibitoria mínima (CIM) mediante el método de dilución en agar, según lo establecido por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (15). Los antibióticos probados fueron cefotaxima, ceftazidima, piperacilina/tazobactam, aztreonam, imipenem, ertapenem, meropenem, gentamicina, tobramicina, amikacina, ácido nalidíxico y ciprofloxacino.

Se hizo el estudio fenotípico de todas las cepas para determinar la presencia de BLEE mediante la prueba de sinergia de doble disco, según lo establecido por el CLSI (15).

Preparación del ADN genómico

El ADN total se extrajo mezclando varias colonias provenientes de cultivos frescos en 200 µl de agua destilada estéril. Estas suspensiones se congelaron a -20 °C durante 30 minutos y luego se sometieron a ebullición durante 15 minutos. Los residuos celulares se separaron por centrifugación (13.000 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente) y el ADN disuelto en el sobrenadante se recuperó en un tubo Eppendorf estéril, el cual se almacenó a -20 °C hasta el momento de su uso.

Detección de los grupos filogenéticos

Los aislamientos se clasificaron en los filogrupos A, B1, B2 y D con base en la presencia de los genes chuA, yjaA y el fragmento génico TspE4.C2, mediante amplificación por PCR en las condiciones previamente establecidas (16) y utilizando los iniciadores descritos en el cuadro 1.

Los resultados se interpretaron con base en el esquema de Clermont, et al. (4), estableciendo la ausencia (-) o presencia (+) de los elementos ya mencionados, así: grupo A: chuA(-) y TspE4.C2 (-); B1: chuA(-) y TspE4.C2 (+); B2: chuA(+) y yjaA (+), y D: chuA(+) y yjaA (-). En estos ensayos se utilizaron como cepas de control E. coli LMM36-ULA (chuA+ y yjaA +) y E. coli LMM32-ULA (TspE4.C2 +).

Detección y secuenciación de los genes bla TEM, bla SHV y bla CTX-M

En la detección de los genes codificantes para TEM, SHV y CTX-M en las cepas estudiadas, se utilizaron los iniciadores señalados en el cuadro 1 y las condiciones de amplificación descritas en estudios previos (17-20).

En los ensayos se utilizaron las siguientes cepas de control: Klebsiella pneumoniae AMKP135-ULA (TEM-1 y SHV-5), K. pneumoniae LMM28-ULA (CTX-M-1), K. pneumoniae LMM29-ULA (CTX- M-2), K. pneumoniae Kpn206-ULA (CTX-M-8) y Citrobacter freundii LMM07/10-ULA (CTX-M-9).

Los amplicones se purificaron utilizando el sistema PCR-Accuprep (Bioneer) y se secuenciaron utilizando los servicios de Macrogen, Inc. (Seúl, Corea) mediante electroforesis capilar en un secuenciador modelo ABI3730XL (Applied Biosystems, CA, USA), con los mismos iniciadores usados en la reacción de PCR. Las secuencias de nucleótidos resultantes se analizaron con el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) del National Center for Bio- technology Information (NCBI) y se compararon con las secuencias genéticas incluidas en las bases de datos (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Detección de genes de virulencia

Se estudiaron seis genes de virulencia: la cápsula polisacárida específica del grupo II (kpsMTII), la adhesina de la fimbria de tipo 1 (fimH), la fimbria P (papAH), el marcador de isla de patogenia, la yersiniabactina (sideróforo fyuA) y la proteína específica uropatógena (usp). Los genes kpsMTII y fimH y la isla de patogenia se detectaron mediante una PCR múltiple y, el resto de genes estudiados mediante PCR simple, utilizando los iniciadores señalados en el cuadro 1 y las condiciones de amplificación previamente establecidas (16). Las cepas de control utilizadas en estos ensayos fueron E. coli LMM/E02-ULA (fimH+, fyuA+, kpsMTII + y PAI +), E. coli LMM/Sc03-ULA (papAH+) y E. coli LMM/E02-ULA (usp+).

Relación clonal de E. coli mediante rep-PCR

La relación clonal de esta colección de cepas se determinó mediante la amplificación de secuencias repetitivas por PCR (rep-PCR) a partir del ADN total, utilizando los iniciadores señalados en el cuadro 1 y las condiciones previamente descritas (23). La mezcla de reacción se hizo en un volumen final de 25 µl. Los patrones obtenidos en la rep- PCR se analizaron con el programa TREECON 1.3b, el cual generó el dendrograma, o árbol de similitud, para establecer las relaciones entre las cepas estudiadas. Los patrones con coeficientes de similitud superiores a 90 % se consideraron relacionados a nivel clonal.

Todos los ensayos de PCR se hicieron en un termociclador Perkin Elmer (GeneAmp PCR System 2400®, USA), los productos amplificados se separaron en geles de agarosa (Sigma-Aldrich Co.®, St. Louis, MO, USA) al 1 %, se tiñeron con bromuro de etidio (0,5 µg/ml; Sigma-Aldrich) y se fotografiaron con un equipo UVP Biodoc-ItSystem®, USA. Como marcadores de peso molecular se utilizaron escaleras de 50 y 100 pb (Bioneer).

Resultados

Las aislamientos evaluados en este estudio, provenientes de pacientes con infecciones asociadas a la atención en salud, fueron resistentes a las cefalosporinas de amplio espectro en rangos que oscilaron entre 4 y >128 µg/ml. Nueve (75 %) de las 12 cepas demostraron sensibilidad a piperazilina-tazobactam, con una CIM entre 2 y 16 µg/ml, mientras que el 100 % fue sensible a los carbapenémicos (CIM: 0,008-0,125 µg/ml). Estos resultados y los obtenidos al utilizar la prueba SDS evidenciaron que las cepas estudiadas eran productoras de BLEE. Por otra parte, ocho (66,6 %) de las 12 cepas presentaron resistencia conjunta a las quinolonas y los aminoglucósidos, y en el resto (4/12; 33,3 %) se encontró una disminución de la sensibilidad a un solo grupo de estos antibióticos (cuadro 2).

Las características genéticas de las cepas ExEC se muestran en la figura 1. Cuatro de las cepas pertenecían a los grupos A (33,3%) y B1 (33,3 %), tres al D (25 %) y una al B2 (8,3 %). En relación con la distribución del número y el tipo de betalactamasas, se pudo observar que el gen bla CTX-M fue el más frecuente al detectarse en todas las cepas estudiadas; la CTX-M-8 fue la variante más común, seguida por CTX-M-15 y CTX-M-2. La presencia asociada de, por lo menos, dos tipos de betalactamasas se demostró en cinco cepas, de las cuales tres pertenecían al filogrupo B1 y, las dos restantes, a los grupos A y B2, respectivamente. Dos de las cepas pertenecientes al filogrupo B1 eran productoras de CTX-M-9 y de CTX-M-8, y una de ellas se asoció, además, a una betalactamasa del tipo TEM-1. Mediante el análisis de la secuencia genética de estas cepas, se determinó la presencia de dos alelos de CTX- M-9: bla CTX-M-65, con un porcentaje de identidad de 98 % con el patrón de referencia KC121030.1 (GenBank), y bla CTX-M-147 , con un 83 % de identidad con el patrón KF513180.1 (GenBank).

En dos cepas pertenecientes a los filogrupos A y B1, se observó la producción de SHV-2a y de bla CTX-M; en ambos grupos filogenéticos, esta BLEE se asoció específicamente con la CTX-M-2 y la CTX-M-15, respectivamente. CTX-M-15, respectivamente. En cuanto a los factores determinantes de virulencia, 11 (91,7 %) de las 12 cepas presentaron, por lo menos, dos de los seis genes estudiados, y el fimH (9/12; 75 %) fue el más frecuente. No obstante, el kpsMTII solo se detectó en las cepas pertenecientes a los filogrupos B2 y D. Independientemente del filogrupo y del perfil de betalactamasas, los genes de virulencia se distribuyeron en distintos patrones; es de resaltar que en la única cepa del grupo B2 se expresaron los seis genes en estudio. Esta cepa y las que conformaron el filogrupo D, albergaron el mayor número de los factores determinantes de patogenia analizados en este trabajo.

La relación clonal establecida mediante rep-PCR permitió demostrar que más de la mitad de las cepas estudiadas se distribuyeron en tres grupos principales, aproximadamente, con 72 % de similitud (figura 1), aunque se destacó un subgrupo conformado por dos cepas (LMM-X5 y LMM-X7) con una relación cercana al 82 %. Las cepas con relaciones distantes no superaron un índice de similitud de 40 %. La distribución clonal fue diversa e independiente de las características fenotípicas y genéticas de cada cepa.

Discusión

En este trabajo se demostró que el 100 % de las cepas analizadas provenientes de hospitales eran resistentes a las cefalosporinas de amplio espectro y a los monobactámicos. Este perfil fenotípico era congruente con la detección de varios genes de BLEE, como el blaTEM , el blaSHV y el blaCTX-M, y además, en el análisis fenotípico todas las cepas demostraron resistencia a otros grupos de antimicrobianos, como los aminoglucósidos y las quinolonas. Guzmán, et al. ( 24), obtuvieron resultados similares a partir de aislamientos de enterobacterias de pacientes con infecciones asociadas a la atención en salud en el Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” de Cumaná en Venezuela, ya que se encontraron los genes blaTEM-1, blaSHV-1, blaSHV-5, blaSHV-5-2a y blaCTXM-1. Por otra parte, en otros estudios se ha reportado el aislamiento de E. coli productoras de BLEE en heces de niños asintomáticos residentes en zonas urbanas de Bolivia, lo cual demuestra la amplia diseminación de ExEC portadora de genes BLEE en la comunidad (25).

El empleo de técnicas moleculares ha permitido la caracterización de las diferentes betalactamasas, así como determinar su distribución y sus variantes alélicas. Se han reportado seis grupos principales en la CTX-M: blaCTX-M-1, blaCTX-M-2 , blaCTX-M-8, blaCT-XM-9, bla CX-M-25 y blaCTX-M-45; blaCTX-M-15 ha sido el de mayor diseminación, con un comportamiento pandémico. En los últimos años, se ha reportado en Argentina, Bolivia, Colombia, Perú y Venezuela (24-29) la presencia de otras variantes: blaCTX-M-2, blaCTX-M-8 y blaCTXM-9 (variente blaCTX-M-65), además de la asociación con blaSHV y blaTEM, y la resistencia simultánea a otros grupos de antimicrobianos en aislamientos provenientes de hospitales y de la comunidad (8-9,30). Dichos hallazgos coinciden con los de la presente investigación, en la cual se evidenció un predominio de aislamientos productores de blaCTX-M-8, blaCTX-M-2 y blaCTX-M-15, a pesar del número reducido de cepas no relacionadas a nivel clonal que se analizaron.

Es importante destacar que en este estudio se detectaron dos variantes alélicas infrecuentes, la blaCTX-M-65 y la blaCTX-M-147 , asociadas a otras BLEE. No hay descripciones de blaCTX-M-147 a nivel clínico o veterinario, y solo se conoce el registro de la secuencia genética en el Genbank (KF513180.1), en tanto que la blaCTX-M-65 se ha reportado en China en aislamientos provenientes de heces de animales sanos de granja y de mascotas, así como en muestras humanas (31-33). La primera descripción de blaCTX-M-65 en Suramérica se hizo en Bolivia en el 2012, a partir de hisopados rectales de niños sanos (25).

En cuanto a los grupos filogenéticos, los grupos A y B1 fueron los más frecuentes seguidos por el grupo D y, en menor proporción, el B2. Estos resultados difieren de los datos reportados en diversos países, donde el filogrupo B2 se ha reportado como el más prevalente en infecciones asociadas a la atención en salud (34-39).

A pesar de que los grupos A y B1 se caracterizan por la presencia de pocos genes de virulencia, dicha condición no constituye un impedimento para la producción de infecciones extraintestinales (5,21,40); de hecho, los factores que median la adhesión bacteriana y los sistemas de captación de hierro (fimH y fyuA), se han detectado en todos los grupos filogenéticos investigados, lo que evidencia el papel fundamental que desempeñan estos genes en la colonización, la supervivencia, el desarrollo y la instauración de un proceso infeccioso (41-43).

La relación de los genes que median la resistencia a los betalactámicos y la carga conjunta de factores de virulencia no demostraron ser específicas de un filogrupo en particular, lo cual coincide con lo descrito por Yun, et al. (44). Por el contrario, Johnson, et al. (21), determinaron la existencia de una relación inversamente proporcional entre el número de factores de virulencia y la presencia de genes de resistencia en cepas de E. coli de filogrupos diferentes. Es probable que la coexistencia de factores determinantes de virulencia y de mecanismos de resistencia en cepas de E. coli sea el resultado de un proceso de evolución gradual concertada; además, la asociación de estas características depende del nicho ecológico, la presión selectiva del ambiente, las características bacterianas en diferentes regiones geográficas y de la reacción del sistema inmunitario del huésped sensible (2,8,44).

Los resultados permiten concluir que, en las diferentes áreas del Servicio de Medicina Interna del IAHULA, circulan cepas de E. coli extraintestinales con una diversidad genética amplia y sin relación clonal estrecha. Esta característica se evidenció por la presencia de todos los filogrupos en los aislamientos de E. coli estudiados, en los cuales se expresaban diversos factores de virulencia y factores determinantes de resistencia antimicrobiana.

Es importante destacar, además, que en este trabajo se describen por primera vez variantes alélicas emergentes de BLEE del tipo CTX-M desconocidas en Venezuela, la blaCTX-M-65 y la blaCTX-M-147 .

Estos hallazgos indican que es imperativo mantener las medidas básicas de higiene, asepsia y antisepsia, con el fin de evitar la transmisión horizontal de microorganismos potencialmente patógenos, así como implementar programas de vigilancia epidemiológica que permitan racionalizar el uso de los antimicrobianos de amplio espectro, y reforzar los protocolos para prevenir y controlar las infecciones asociadas a la atención en salud.

Conflicto de intereses

Las autoras declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Financiación

Este trabajo fue parcialmente financiado por el Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico, Tecnológico y de las Artes de la Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela (CDCHTA-ULA), códigos: ADG FA-02-97-07 y FA-554-14-03EM.

Correspondencia:Beatriz Millán, Laboratorio de Microbiología Molecular, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Sector Campo de Oro, Mérida 5101, VenezuelaTelefax: (58) (274) 266 7601 bmillanm@ula.ve

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