ARTÍCULO ORIGINAL

Estandarización de una prueba múltiple de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la identificación de Angiostrongylus cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum

Standardization of a multiplex real-time PCR test for the identification of Angiostrongylus cantonensis, A. costaricensis and A. vasorum

Rubén E. Varela-M1, 2; Jinney Stefany Arias3; Luz Elena Velásquez3, 4*

1 Unidad de Biología Molecular y Computacional, Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET), Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia
2 Facultad de Ciencias Básicas, Universidad Santiago de Cali, Cali, Colombia
3 Grupo de Microbiología Ambiental, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia
4 Unidad de Malacología Médica y Trematodos, Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET), Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia

* Correspondencia: Luz Elena Velásquez, Unidad de Malacología Médica y Trematodos, Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET), Sede de Investigación Universitaria, Universidad de Antioquia, Calle 62 N° 52-59, laboratorio 730, Medellín, Colombia Teléfono: (574) 219 6514
Contribución de los autores:* Rubén E Varela-M: diseño metodológico y de la prueba molecular Jinney Stefany Arias: estandarización de técnicas moleculares Luz Elena Velásquez: diseño del estudio, consecución de moluscos, aislamiento de larvas y obtención de financiación Todos los autores participaron en la escritura del manuscrito.
Conflicto de intereses* Los autores declaran que no existe ningún tipo de conflicto de intereses.

Recibido: 2016 Septiembre 13; Aceptado: 2017 Mayo 27



Resumen

Introducción.

En el mundo, las angiostrongilosis de mayor impacto en salud humana y animal son ocasionadas por Angiostrongylus cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum. En las personas, las formas clínicas son la meningitis eosinofílica y la angiostrongilosis abdominal, y, en los mamíferos cánidos, el daño cardiopulmonar. Se las consideran enfermedades emergentes debido a la propagación mundial del caracol africano Lissachatina fulica, un huésped intermediario de los parásitos.

Los escasos métodos de identificación de Angiostrongylus spp. no son muy específicos ni sensibles y son costosos. Se necesita urgentemente una herramienta diagnóstica asequible, sensible y específica para el manejo de las angiostrongilosis humana y la animal.

Objetivo.

Desarrollar una prueba de PCR múltiple en tiempo real (qPCR) para identificar las tres especies patógenas de Angiostrongylus.

Materiales y métodos.

Mediante un análisis bioinformático se seleccionó una secuencia del genoma ITS-2 de Angiostrongylus para garantizar la especificidad del cebador y las sondas. El ADN de los parásitos adultos (control positivo) y de las larvas se extrajo con el estuche DNeasyBlood & Tissue®.

Las reacciones de la PCR cuantitativa se ejecutaron en un termociclador Smartcycler Cepheid®, usando el estuche de mezcla maestra QuantiTect®. Como control negativo, se utilizó ADN humano, de otros parásitos y del caracol africano.

Resultados.

Los valores del ciclo umbral para los controles positivos de ADN fueron: 21 para Angiostrongylus cantonensis, 22 para A. costaricensis y 31 para A. vasorum. En los controles negativos, el ciclo umbral fue cero. La qPCR mostró una eficiencia de amplificación de 2 (100 %).

Conclusiones.

En el laboratorio se estandarizó una qPCR múltiple para tres especies clínicamente significativas de Angiostrongylus.

Palabras clave: Angiostrongylus, Angiostrongylus cantonensis, reacción en cadena en tiempo real de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa multiplex.


Abstract

Introduction:

Angiostrongyliasis is a disease caused by Angiostrongylus nematodes that is present worldwide. The infections with the highest impact on human and animal health are caused by A. cantonensis, A. costaricensis, and A. vasorum. Clinical forms of the disease in humans are eosinophilic meningitis and abdominal angiostrongyliasis, while the most common effect on dogs are cardiopulmonary damages. It is deemed as an emerging disease as the result of the global dissemination of the African snail Lissachatina fulica, an intermediary host of these parasites. The few diagnostic methods for Angiostrongylus spp. are unspecific, costly, and not very sensitive. It is urgent to develop a sensitive, specific and accessible diagnostic tool for the control of human and animal angiostrongyliasis.

Objective:

To develop a qPCR multiple test to identify the three pathogenic species of Angiostrongylus.

Materials and methods:

Through a bio-informatic analysis, we selected a sequence of the ITS-2 region of the Angiostrongylus genome to guarantee the specificity of primers and probes. We extracted DNA from adult parasites as positive control, and from larvae using the DNeasy Blood&Tissue® kit. Quantitative PCR reactions were conducted on a Smartcycler Cepheid® thermocycler using a master mix QuantiTect® kit. DNA from human beings, other parasites and the African snail was used as negative control.

Results:

The threshold cycle values for positive DNA controls were: 21 for Angiostrongylus cantonensis, 22 for A. costaricensis, and 31 for A. vasorum. In negative controls, the threshold cycle was zero. qPCR showed an amplification efficiency of 2 (100%).

Conclusions:

A multiple qPCR was standardized at the laboratory for three clinically significant species of Angiostrongylus.

Key words: Angiostrongylus, Angiostrongylus cantonensis, real-time polymerase chain reaction, multiplex polymerase chain reaction.

Los nematodos emergentes Angiostrongylus cantonensis, hallado por primera vez en Cantón, China, por Chen (1935), Angiostrongylus costaricensis, reportado en humanos por Céspedes y Morera (1967) en Costa Rica y Angiostrongylus vasorum, detectado por primera vez en Francia por Baillet (1866), son agentes causales de enfermedades de difícil diagnóstico en personas y animales en los cinco continentes 1-4. El ciclo de vida de estos parásitos se caracteriza porque requiere de un molusco terrestre como huésped intermediario. Colombia sufre la invasión del gigante africano Achatina (=Lissachatina) fulica Bowdich, 1822, un caracol terrestre endémico del este de África cuya distribución actual es pantropical. Este molusco consume plantas y desechos orgánicos de origen animal, incluso heces, hecho que favorece su interacción con numerosas especies parásitas.

En Brasil, Ecuador y Venezuela, el caracol africano es una plaga y se ha demostrado que funge como huésped intermediario de A. cantonensis. En Brasil, también se ha establecido que es huésped intermediario de A. vasorum y se sugiere como huésped potencial de A. costaricensis5-8.

La presencia de A. cantonensis en Brasil, Ecuador y Venezuela representa un gran riesgo para la salud pública en Colombia. El parásito adulto se aloja en la arteria pulmonar de roedores que eliminan las larvas de primera etapa (L1 ) en las heces 9, y los caracoles se infectan con estas larvas al comer las heces del roedor. Dentro del molusco, la larva se desarrolla en las etapas L2 y L3 , para luego abandonar el huésped invertebrado 10. Además, el nematodo tiene huéspedes paraténicos, como crustáceos, sapos y planarias, que facilitan su dispersión a diversos ecosistemas donde habitan mamíferos, aves y personas, los cuales son huéspedes accidentales en riesgo de contraer la enfermedad 9,11.

Angiostrongylus cantonensis está distribuido en todos los continentes con un mayor número de casos en Asia 7. En las personas ocasiona meningitis eosinofílica, generada por las larvas L3 procedentes de los caracoles, las cuales ingresan en los pacientes por la vía oral, penetran la pared intestinal y viajan por el torrente sanguíneo hasta el cerebro, donde causan daño tisular y reacción inflamatoria 9,12. La sintomatología es inespecífica, y depende de la ubicación y el número de larvas que ingresan al cerebro, donde puede generar dolor de cabeza, alteraciones neurológicas, coma y la muerte 7.

El parásito A. costaricensis es el agente etiológico de la angiostrongilosis abdominal en humanos y se caracteriza por causar dolor abdominal en la fosa ilíaca derecha. Es muy prevalente en Brasil y en Costa Rica, con más de 600 casos por año, cifras que probablemente son mayores a causa del subregistro asociado con la dificultad para el diagnóstico. Se desconoce su prevalencia e incidencia en los otros países de Latinoamérica 13. En Argentina, México y Venezuela, algunos pacientes se han diagnosticado mediante intervención quirúrgica; en Colombia, todos los casos se han registrado con base en el diagnóstico post mortem14. Este nematodo se aloja en la arteria mesentérica de diversas especies de roedores que actúan como reservorios o huéspedes definitivos 15.

El nematodo A. vasorum, conocido como el gusano del corazón, es endémico en Europa, con registros en África, América y Asia. Ocasiona problemas en la salud de perros y zorros, en el tejón europeo y en el panda rojo. Los parásitos adultos se localizan en el ventrículo derecho y en la arteria pulmonar del mamífero, donde ocurre la reproducción sexual; las hembras ponen huevos de los cuales salen las larvas L1, las cuales migran de los alvéolos al árbol bronquial para luego ser deglutidas y excretadas en las heces 16-18. Estas son ingeridas por moluscos, ranas y lagartos, con lo cual se facilita el contacto del parásito con los perros y otros mamíferos cánidos 18,19.

La enfermedad puede ser asintomática o presentar manifestaciones poco específicas, como tos, ahogamiento, fatiga, neumonía, hemorragias, fibrosis pulmonar, disnea, pérdida de peso, vómito, dolor abdominal y enfermedad cardiopulmonar. El cuadro clínico se complica por migraciones aberrantes a otros órganos y puede ocasionar la muerte súbita 16,20.

A pesar del impacto de A. cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum en la salud pública a nivel mundial, su diagnóstico no es fácil. Las técnicas parasitológicas habituales no pueden aplicarse en las personas, porque en las heces no se eliminan estadios del parásito y la sintomatología no es patognomónica; por esto, se han desarrollado diferentes pruebas convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

La PCR es una técnica rápida, sensible y específica que amplifica el ADN de una sola especie de forma exponencial durante diferentes ciclos y temperaturas a partir de un par de cebadores 21,22. Sin embargo, existe una variante de la PCR convencional, la PCR múltiple en tiempo real (quantitative PCR, qPCR), la cual permite amplificar en una sola reacción dos o más secuencias de ADN, utilizando varias parejas de cebadores, y facilitando la detección, identificación y cuantificación simultánea de distintos genes de interés. No obstante, se requiere un buen diseño para evitar uniones inespecíficas entre cebadores, así como para optimizar el programa de amplificación y sondas múltiples con fluorescencia 23,24.

En Colombia, como en otros países de Suramérica, A. fulica y los roedores que constituyen plagas poseen una distribución geográfica amplia, son abundantes y sinantrópicos 25, lo que para las personas y la fauna implica el riesgo de adquirir una angiostrongilosis debido a la presencia en el continente de A. cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum. La evaluación del problema y el diseño de estrategias para su prevención y control demandan herramientas para el diagnóstico de los helmintos en diversos huéspedes.

Como respuesta a esa necesidad, se propuso desarrollar lo que sería la primera prueba de qPCR múltiple en el mundo para la identificación, en una sola reacción, de las tres especies de Angiostrongylus de importancia en salud humana y animal.

Materiales y métodos

Diseño de oligonucleótidos y análisis bioinformáticos

Las regiones o genes seleccionados para amplificar se eligieron con base en los registros de otros artículos en los que se había empleado la región ITS-2 (Internal Transcribed Spacer) para el diagnóstico 26.

Con el fin de determinar y verificar los polimorfismos presentes en la región seleccionada para la amplificación mediante sondas Taq-ManTM, se hizo un alineamiento múltiple utilizando las secuencias reportadas en las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) con el programa T-Coffee. Los alineamientos se visualizaron en MEGA 6 o Jalview.

En la región seleccionada, el polimorfismo en las tres especies fue suficiente para el diseño específico de los cebadores y de las sondas Taq- ManTM. Con el programa Primer Quest se obtuvieron las secuencias de los cebadores a partir de aquellas preseleccionadas en la herramienta BLAST para la ITS-2 intraespecie. Se tuvieron en cuenta parámetros como el tamaño del cebador, la temperatura media de fusión, el contenido de guanina-citosina (GC) (%GC) y el tamaño de la secuencia que debía amplificarse. Con el programa Oligoanalyzer, se evaluó la formación de estructuras secundarias y de homodímeros o heterodímeros según el delta de G (ΔG) generado. Posteriormente, con la herramienta Blastprimer (NCBI), se evaluó la posibilidad de alineamientos inespecíficos de los cebadores frente al genoma humano y otros parásitos.

Con el programa Clustal W, se realizó un alineamiento múltiple entre las secuencias elegidas y los cebadores para garantizar el alineamiento tanto en sentido como en antisentido y la amplificación específica de cada una de las secuencias blanco Vs. las secuencias de otras especies (humanos, nematodos y caracol africano).

Obtención de parásitos de Achatina fulica

Se recolectaron 60 caracoles en Santa Fe de Antioquia. Se sacrificaron y trocearon para digerirlos en ácido clorhídrico (HCl) al 0,7 %. Luego se recuperaron las larvas de los nematodos con el método de Bearmann 25,26; se observaron con un estereomicroscopio Nikon SMZ445 y se contaron. El 70 % de las larvas de cada caracol se lavó con suero fisiológico y se almacenó en alcohol al 96 % y a 4 °C para la extracción de ADN; el 30 % restante se procesó para su observación y descripción bajo microscopio convencional y de barrido. Se tomaron fotografías y videos (no se muestran).

Extracción del ADN

El ADN de los parásitos se extrajo con el estuche DNeasy Blood & Tissue® (Qiagen, Hilden, Alemania) según el protocolo del fabricante. Se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop ND1000® (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) y se conservó en un congelador a -20 °C hasta su amplificación.

La calidad del ADN purificado se evaluó por electroforesis convencional en un gel de agarosa al 2,0 %, y se determinó su pureza de extracción en relación con una absorbancia de 260/280 unidades de densidad óptica (DO). En el gel se utilizó un volumen de 5 μl del colorante de ADN SafeViewTM, la fluorescencia del producto de PCR se visualizó y la imagen se almacenó en un documentador de imágenes Gel Doc® (Bio-Rad). El ADN se almacenó en un congelador a -20 °C hasta su procesamiento.

Muestras evaluadas mediante PCR

Se evaluaron inicialmente los controles positivos a partir del ADN total de Angiostrongylus spp. suministrado por pares internacionales: A. vasorum (Stefanski Institute of Parasitology, Polonia), A. vasorum (Universidad de Bristol, Reino Unido), A. cantonensis (Universidad de Hawaii), A. cantonensis (Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil) y A. costaricensis (Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET), Universidad de Costa Rica). Como controles negativos, se utilizaron muestras de ADN de Strongyloides stercoralis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura, Ancylostoma duodenale-Necator americanus e Hymenolepis nana, ADN de humano (células de referencia de cultivo) y ADN de A. fulica.

PCR convencional

Con los controles positivos y negativos, se realizó una PCR convencional en un termociclador C1000 de Bio Rad para estandarizar las condiciones iniciales del programa de amplificación que se usaron luego en la qPCR. Se verificaron el tamaño y la especificidad de cada producto amplificado en un gel de agarosa al 2 %.

El perfil térmico usado como patrón fue el siguiente: 95° C durante 3 minutos; 35 ciclos a 95 °C durante 30 segundos; 55 a 62 °C durante 1 minuto, y 72 °C durante 30 segundos. Luego se sometieron a 72 °C durante 4 minutos para garantizar que todos los productos de amplificación estuvieran terminados y con la misma longitud. El volumen final de esta reacción fue de 25 μl.

PCR en tiempo real con sonda Taq-Man TM

La qPCR se hizo utilizando cada oligonucleótido y cada sonda en una concentración entre 0,1 y 0,5 pmol/μl (no se mencionan las secuencias usadas para proteger el proceso de solicitud de patente). La mezcla de reacción que se usó para la amplificación fue el estuche QuantiTect Multiplex PCR NoROX® (Qiagen). Se utilizó una concentración de ADN de 9 a 14 ng/μl por muestra, para un volumen final de 25 μl por reacción. La reacción se llevó a cabo en el termociclador SmartCycler Cepheid®.

Las lecturas de fluorescencia de los controles positivos se hicieron después de la amplificación y se registraron los valores de ciclo umbral correspondientes a su positividad.

Para determinar el programa final óptimo de amplificación, se utilizó un rango de temperatura entre 57 y 63 °C. Durante el proceso de estandarización, los controles positivos y negativos se evaluaron como mínimo por triplicado para confirmar su reproducibilidad y, posteriormente, se calculó la eficiencia de la amplificación.

Evaluación de la interferencia de ADN

Para verificar la posible interferencia que genera el alto contenido de ADN en las muestras, se tomaron 14 ng de ADN total purificado del parásito (A. cantonensis, A. costaricensis y A. vasorum), se mezclaron con diferentes concentraciones de ADN extraído de caracoles A. fulica (1 ng/μl, 5 ng/μl, 10 ng/μl, 25 ng/μl, 75 ng/μl y 100 ng/μl) y, en cada caso, se hizo una qPCR múltiple.

Aspectos éticos

Este estudio contó con el aval del Comité de Ética para la Experimentación con Animales de la Universidad de Antioquia, Acta 93, 29 de enero de 2015. La prueba diagnóstica de amplificación de ADN se ajustó a la Resolución 008430, que establece los lineamientos científicos, técnicos y administrativos para la investigación en salud.

Resultados

Diseño computacional y estandarización in vitro

El diseño de los cebadores y sondas mediante los métodos computacionales utilizados a partir de la secuencia ITS-2, demostró ser el óptimo para la qPCR múltiple. No se observó interferencia inhibitoria o competitiva entre los nueve oligonucleótidos usados durante el proceso de amplificación, ni siquiera cuando los cebadores y las sondas se encontraban en una concentración mayor de 0,2 pmol en una misma reacción de qPCR. La eficiencia de amplificación hallada durante los 40 ciclos del programa de PCR fue óptima, calculada en 2 (100 % de eficiencia) para este gen.

En cuanto a la marcación de las sondas Taq-ManTM con los fluoróforos Texas-Red, Cy5 y FAM, todas mostraron niveles de fluorescencia detectables que superaron el punto de corte para la qPCR. Sin embargo, se sugiere que, para obtener una mayor sensibilidad de amplificación en A. vasorum, el Cy5 puede sustituirse, porque su punto de corte no fue inferior a 30 ciclos en ningún caso.

En cuanto a los controles negativos (ADN de parásitos, humanos y caracol africano), ninguno amplificó durante los 40 ciclos, lo cual confirma la especificidad del diseño de cebadores y sondas.

Durante la estandarización del programa de qPCR, se determinó que la temperatura de anillamiento específica para todos los oligonucleótidos utilizados fue de 60 °C, en una concentración estandarizada para cada cebador de 0,2 pmol y de 0,3 pmol para cada sonda.

Los valores de punto de corte obtenidos para cada control positivo fueron los siguientes: 21 para A. cantonensis, 22 para A. costaricensis y 31 para A. vasorum (figura 1-figura 2, figura 3).


Figura 1 Amplificación del ADN de Angiostrongylus cantonensis. Punto de corte (Threshold cycle, Ct): 21.94 (línea azul) mediante qPCR múltiple


Figura 2 Amplificación del ADN de Angiostrongylus costaricensis. Punto de corte (Threshold cycle, Ct): 22.82 (línea naranja) mediante qPCR múltiple


Figura 3 Amplificación del ADN de Angiostrongylus vasorum. Punto de corte (Threshold cycle, Ct): 31.23 mediante qPCR múltiple Uunidades relativas de fluorescencia

El programa final estandarizado para amplificar mediante qPCR el ADN de Angiostrongylus en el termociclador Smartcycler Cepheid®, fue el siguiente: 95 °C durante 15 minutos, 40 ciclos a 95 °C durante 15 segundos y a 60 °C durante 60 segundos, para un tiempo total de amplificación de 65 minutos.

El programa estandarizado en la PCR convencional fue el siguiente: 95 °C durante 3 minutos, 35 ciclos a 95 °C durante 30 segundos, a 57,3 °C durante 1 minuto y a 72 °C durante 30 segundos, y a 72 °C durante 4 minutos, en un volumen final de 25 μl.

En cuanto a la posible interferencia ocasionada por la cantidad de ADN presente en las muestras, se determinó que hasta los 100 ng de ADN no había efecto inhibitorio o competitivo contra la secuencia blanco de la amplificación, lo cual corresponde a una relación de 1:7, es decir, no hubo inhibición de la qPCR, al menos, hasta un grado siete veces por encima de la concentración de ADN usada (figura 4).


Figura 4 Evaluación de la interferencia del ADN de Achatina fulica en la amplificación mediante qPCR múltiple. Las seis líneas de inferior a superior indican las siguientes concentraciones de ADN: 1 ng/μl, 5 ng/μl, 10 ng/μl, 25 ng/μl, 75 ng/μl y 100 ng/μl).

Extracción de ADN

La qPCR fue positiva con el ADN total suministrado por los pares internacionales y con el ADN purificado de un humano adulto, donado por estos mismos investigadores internacionales y utilizado como control positivo.

En la fase de estandarización de la extracción del ADN de las larvas de nematodos obtenidas de caracoles africanos provenientes de Santa Fe de Antioquia, se observó que no se recuperó más ADN ni de mejor calidad cuando se extrajo de más de tres larvas.

Las larvas que se analizaron durante la estandarización de la qPCR fueron negativas para las tres especies de Angistrongylus evaluadas. No obstante, en todos los caracoles se encontraron diversos parásitos con diferentes morfotipos de larvas de nematodos, los cuales están en proceso de identificación.

Discusión

Los métodos diagnósticos microbiológicos e inmunológicos actuales no son muy útiles para la identificación de Angiostrongylus. La meningitis eosinofílica causada por A. cantonensis se diagnostica en gran medida a partir de datos epidemiológicos y de la sospecha clínica, lo que es posible cuando el personal está entrenado y alertado. Para el diagnóstico en el laboratorio se han desarrollado algunas PCR de poca sensibilidad y resultados contradictorios, pruebas que no están disponibles en el comercio 15,24,27-35.

El diagnóstico confirmatorio de la angiostrongilosis abdominal solo es posible con la observación del nematodo en el material histopatológico obtenido mediante intervención quirúrgica 9.

Existen pruebas de antígenos, precipitación de partículas en látex, ELISA y una PCR que usa cebadores construidos a partir de secuencias de A. cantonensis, los cuales presentan reacciones cruzadas y carecen de los registros para confirmar su reproducibilidad, sensibilidad y utilidad en el diagnóstico clínico y epidemiológico 9,36-40.

Aunque la presencia de A. costaricensis en Colombia se ha confirmado en el diagnóstico post mortem de personas, se desconocen la prevalencia, la incidencia y la frecuencia de esta parasitosis 14.

Para el diagnóstico de A. vasorum, la prueba de referencia es el método de Baermann, que tarda entre 8 y 36 horas, presenta poca sensibilidad porque depende de la carga parasitaria y requiere de personal entrenado. Existe una prueba ELISA de tipo sándwich y algunas PCR con poca especificidad.

En el comercio solo está disponible la prueba Angio Detectar TestTM para el diagnóstico en perros, pero no es útil en huéspedes intermediarios y su especificidad está validada contra tres especies de nematodos diferentes a A. vasorum41-47 (Muniz de Paiva Barçante J. Aspectos clínicos, parasitológicos e imunológicos de cães experimentalmente infectados por Angiostrongylus vasorum. XIII Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária e I Simpósio Latino-Americano de Ricketisioses, Ouro Preto, MG, 2004. Rev Bras Parasitol Vet. 2004;13(Supl.1):96-9).

En este estudio se estandarizó una nueva qPCR múltiple para la identificación específica, sensible y simultánea de tres especies de Angiostrongylus de importancia en salud humana y animal, como resultado del diseño de cebadores específicos que amplifican una región de ITS-2 conservada en las tres especies analizadas, A. vasorum, A. cantonensis y A. costaricensis, pero con la variabilidad necesaria para permitir la diferenciación entre especies.

Con las secuencias de los cebadores utilizados, obtenidas con el uso de herramientas computacionales de libre acceso en internet, se garantizó la especificidad del producto amplificado dado que se tuvieron en cuenta todos los parámetros para el diseño: la temperatura de fusión, el contenido de G-C, la complementariedad entre secuencias, la formación de bucles (hairpins), el tamaño del cebador y otros parámetros definidos por los programas computacionales especializados en el diseño de cebadores.

En general, estos programas están diseñados para crear una o máximo dos parejas de cebadores. Sin embargo, la expectativa metodológica en el presente estudio incluía seis parejas de cebadores y tres sondasTaq-ManTM, que se marcaron con fluoróforos diferentes y bloqueadores de señal específicos para garantizar la emisión de fluorescencia de A. cantonensis (Texas Red/BHQ2), A. costaricensis (FAM/BHQ1) y A. vasorum (Cy5/ BHQ2).

En este sentido, cabe anotar que ninguna de las muestras utilizadas como control negativo se acercó al umbral de fluorescencia del método, por lo cual se hizo una búsqueda muy refinada de cada pareja de cebadores mediante los programas bioinformáticos descritos en la metodología, con lo cual se cumplió con otros parámetros importantes para este caso, por ejemplo, que todas las parejas de cebadores amplificaran la región ITS-2 seleccionada con un tamaño similar en longitud y contenido de G-C para evitar diferencias significativas entre las temperaturas de fusión de las parejas de cebadores y las sondas, ya que el sistema de amplificación múltiple requerido solo funciona bajo una única temperatura de amplificación. El diseño no se comparó con otro porque no se encontraron registros sobre un sistema de amplificación múltiple para Angiostrongylus spp. que identificara las tres especies estudiadas en una sola reacción. En dos estudios sobre la PCR, se utilizaron secuencias ITS-2 como blanco de amplificación y solamente se identificó A. vasorum44,48.

Según lo hallado en los artículos consultados, esta es la segunda ocasión en que se desarrolla un método capaz de detectar las tres especies de Angiostrongylus objeto del estudio 2. Las ventajas de este con respecto al existente (PCR-RLFP) son significativas: no hay contaminación ambiental por los geles de agarosa y sus colorantes, el tiempo de espera del resultado es menor, la interpretación del resultado no está sujeta al error humano por ser automatizada, y es menos costoso, pues no utiliza enzimas de restricción.

Por otra parte, en los ensayos in vitro se corroboró que el método molecular propuesto permite la identificación sensible de, al menos, un parásito.

Con respecto al hecho de que no se recuperó mayor cantidad de ADN cuando se hizo la extracción en más de tres larvas de nematodos, ello podría obedecer a una saturación en la columna de purificación ocasionada por el tamaño de los parásitos y el número de biomoléculas. Los fabricantes de estos estuches, por ejemplo, Qiagen, conocen el fenómeno y lo mencionan.

La prueba que se propone funciona in vitro y se convierte en la nueva y única alternativa para el diagnóstico de las angiostrongilosis en Colombia, por lo que debe ser validada en campo y en la clínica en pacientes y huéspedes en los que se detecte ADN de los parásitos. Una vez validada, la prueba diagnóstica también será útil para determinar zonas con alto riesgo de transmisión por la presencia de varios de los huéspedes de Angiostrongylus, como las ratas y el caracol africano 25.


Financiación Esta investigación se hizo en el marco del proyecto “Control del caracol plaga Achatina fulica en Santa Fe de Antioquia y disminución del riesgo sobre la salud de las personas y la agricultura local con la participación activa de la comunidad”, código 46 0000 10 73, financiado con recursos del programa de regalías 2013, a través de la Secretaría de Agricultura y Desarrollo Rural de Antioquia. También, recibió financiación del Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales (PECET), del Grupo de Microbiología Ambiental, de la Escuela de Microbiología de la Universidad de Antioquia y del Programa Joven Investigador de Colciencias 2014, convenio de beca de pasantía No JIC 169-2014.

Agradecimientos

A las siguientes personas por donar los parásitos (controles positivos) para la estandarización de la prueba: Susan Jarvi (Universidad de Hawaii), Silvana Thiengo (Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil), Eric Morgan (Universidad de Bristol, Reino Unido), Aleksander Demiaszkiewicz (Witold Stefański Institute of Parasitology, Polonia). A Lina Gutiérrez Builes, de la Facultad de Medicina de la Universidad Pontificia Bolivariana, por donar nematodos de diferentes géneros para la prueba (controles negativos). A Jenny Chaparro, de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Antioquia, y a Andrés Montoya y Didier Tirado del PECET, por sus aportes en el proceso de estandarización de la qPCR múltiple. A las unidades de Biología Molecular y Malacología Médica del PECET, por facilitar el laboratorio y los equipos. Al PECET por financiar el transporte de algunas muestras.

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