ARTÍCULO ORIGINAL

Sensibilidad in vitro de cepas cubanas de Aspergillus spp. de origen clínico y ambiental

In vitro susceptibility of Cuban Aspergillus spp. strains of clinical and environmental origin

Javier L. San Juan1; Carlos M. Fernández1; Michel Almaguer2; Mayda R. Perurena1; Gerardo F. Martínez1; Rosario E. Velar1; María T. Illnait1

1 Laboratorio Nacional de Referencia de Micología, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", La Habana, Cuba
2 Facultad de Biología, Universidad de La Habana, La Habana, Cuba

Correspondencia: Carlos M. Fernández, Laboratorio Nacional de Referencia de Micología, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", km 6 1/2, Autopista "Novia del Mediodía", La Lisa, La Habana, Cuba Teléfono: (537) 255 3524
* Conflicto de intereses No existe conflicto de intereses.

Recibido: 2016 Agosto 10; Aceptado: 2016 Diciembre 5



Resumen

Introducción.

En Cuba se desconoce el comportamiento de la sensibilidad de Aspergillus spp. a los antifúngicos recomendados para el tratamiento de la aspergilosis: la anfotericina B, el itraconazol, el voriconazol y las equinocandinas. La influencia del ambiente puede condicionar la aparición de resistencia en estos microorganismos.

Objetivo.

Evaluar la sensibilidad in vitro de cepas de Aspergillus spp. a la anfotericina B, el itraconazol y el voriconazol, y la relación de los patrones de sensibilidad con su origen.

Materiales y métodos.

Se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas de la anfotericina B, el itraconazol y el voriconazol para 60 cepas de Aspergillus spp. de origen clínico y ambiental mediante el método M38-A2 del Clinical and Laboratory Standard Institute.

Resultados.

Se encontraron 21 cepas resistentes a la anfotericina B (principalmente en muestras clínicas y ambientes hospitalarios) y tres cepas resistentes al itraconazol (en ambientes interiores y exteriores no hospitalarios). No se hallaron cepas resistentes al voriconazol. No se encontró relación entre el origen de las cepas y su sensibilidad.

Conclusiones.

Se sugiere la posible existencia de factores ambientales o interacciones con genotipos resistentes que pueden dar origen a fenotipos resistentes en Cuba. Este es el primer reporte del país de cepas de Aspergillus spp. resistentes in vitro. Los resultados ameritan ampliar el estudio para incluir análisis moleculares y filogenéticos.

Palabras clave: Aspergillus, farmacorresistencia fúngica, anfotericina B, itraconazol, voriconazol.


Abstract

Introduction:

The behavior of antifungal susceptibility of Aspergillus spp. in Cuba remains unknown. The antifungals recommended to treat aspergillosis are amphotericin B, itraconazole, voriconazole and echinocandins. The influence of the environment may set off the emergence of drug-resistance in these microorganisms.

Objective:

To evaluate in vitro susceptibility of Aspergillus spp. strains to amphotericin B, itraconazole and voriconazol, and the relationship between susceptibility patterns and their origin.

Materials and methods:

Minimum inhibitory concentrations of amphotericin B, itraconazole and voriconazole were determined for 60 Aspergillus spp. strains of clinical and environmental origin using the M38-A2 method of the Clinical and Laboratory Standards Institute.

Results:

We found 21 amphotericin B resistant strains (mainly from clinical samples and hospital environments), as well as three itraconazole resistant strains (from non-hospital outdoor and indoor environments). No voriconazole resistance was found. No relationship was found between strain origin and susceptibility.

Conclusions:

Results suggest the possible existence of environmental factors or interactions with resistant genotypes which may give rise to resistant phenotypes in our country. This is the first report of in vitro Aspergillus spp. resistant strains in Cuba. These studies should be broadened and include molecular and phylogenetic analyses.

Key words: Aspergillus, drug resistance, fungal, amphotericin B, itraconazole, voriconazole.

El género Aspergillus es probablemente el taxón fúngico de mayor distribución en el mundo por la fácil diseminación de sus esporas y por la amplia gama de sustratos que puede degradar (1).

La interacción con estos microorganismos puede representar un riesgo para la salud humana por la potencial patogenia y la toxicidad que presentan algunas especies. Las infecciones causadas por Aspergillus spp. se manifiestan de muchas maneras, desde formas no invasivas, como la otomicosis, las queratitis fúngicas, la aspergilosis broncopulmonar alérgica y los aspergilomas, hasta infecciones invasivas con posible diseminación a diferentes sistemas de órganos (2).

Entre los principales antifúngicos que se utilizan para el tratamiento contra la infección por Aspergillus spp., están los triazoles (fundamentalmente, el itraconazol y el voriconazol), la anfotericina B y las equinocandinas (3). En las últimas décadas, se ha observado un incremento en la aparición de cepas resistentes a los antifúngicos, fundamentalmente de A. fumigatus (4). Sobre Aspergillus spp. se han realizado múltiples investigaciones para determinar la sensibilidad in vitro de sus especies y los factores ambientales que influyen sobre este patrón (5,6). En Cuba no existe información sobre el tema en el ámbito clínico ni en estudios de micobiota ambiental.

Esta es la primera investigación cubana que pretende evaluar la reacción frente a tres de los principales antifúngicos empleados para tratar la aspergilosis en grupos de especies de Aspergillus con origen clínico y ambiental.

Materiales y métodos

Cepas

Se evaluaron 60 cepas pertenecientes al género Aspergillus organizadas en tres grupos, según su origen: grupo 1 (G1), formado por 20 cepas aisladas de ambientes exteriores e interiores no hospitalarios, proporcionadas por la Colección de Cultivos Microbianos de la Facultad de Biología (CCMFB) del Departamento de Microbiología de la Facultad de Biología de la Universidad de La Habana; grupo 2 (G2), formado por 20 cepas aisladas de ambientes hospitalarios del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) y del Laboratorio de Microbiología del Centro de Investigaciones Médico Quirúrgicas (CIMEQ), y grupo 3 (G3), constituido por 20 cepas aisladas de muestras clínicas provistas por el Laboratorio de Microbiología del Hospital Militar "Luis Díaz Soto", el Laboratorio de Microbiología del CIMEQ y la Colección de Hongos Patógenos del IPK.

Todas las cepas estaban clasificadas según los criterios de identificación de Barnet, et al. (7), Klich, et al. (8), y de Hoog, et al. (9). La distribución según especie fue la siguiente: 19 de A. fumigatus, 20 de A. flavus , 20 de A. niger y una de A. terreus. A todas las cepas se les asignó un código específico, diferente a su original, en aras de homogenizar la nomenclatura.

Cepas de control

Como cepas de control se utilizaron Candida krusei ATCC(r) 6258 y C. parapsilosis ATCC (r) 22019. Los valores de sensibilidad se determinaron dentro de los límites establecidos por el método M38A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (10).

Sensibilidad a los antifúngicos

La determinación de la sensibilidad a la anfotericina B y al itraconazol se hizo con el método de microdilución M38-A2 del CLSI (10). Las soluciones "madre" de cada antifúngico se prepararon con dimetilsulfóxido (DMSO). Las diluciones finales (1:50) se hicieron en el medio RPMI-1640 (SigmaAldrich; USA) usando ácido 3- [N-morfolino] propanosulfónico (MOPS) (Sigma-Aldrich; USA) como solución tampón; el pH se ajustó a un valor de 7,0 ± 0,1. Posteriormente, se distribuyeron 100 µl de las soluciones de los antifúngicos en placas de poliestireno de 96 pocillos de fondo plano (Cellstar (r)). Los inóculos se ajustaron a una concentración de 0,4-5 x 104 conidios por ml mediante conteo en cámara de Neubauer, y se dispensaron 100 µl en los pocillos con los antifúngicos. En cada placa se tuvieron en cuenta un control negativo (medio de cultivo sin antifúngico ni inóculo) y un control de crecimiento (medio con disolvente e inóculo).

Las placas se incubaron a 35 °C durante 48 horas. Los valores de concentración inhibitoria mínima (CIM) para la anfotericina B y para el itraconazol, se establecieron como el menor valor de concentración en el que se observó el 100 % de inhibición del crecimiento y no se observó efecto de arrastre (10). Se determinó la CIM del voriconazol frente a las cepas que mostraron resistencia a la anfotericina B o al itraconazol y, para ello, se emplearon tiras de Etest (r) (bioMérieux; Francia) según la metodología descrita por el fabricante. La preparación y la estandarización del inóculo fueron las mismas que las utilizadas en el procedimiento de microdilución. Se empleó el medio RPMI-1640 con agar como medio de cultivo. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37 °C (11).

La lectura de los datos se hizo siguiendo las indicaciones del fabricante. Los valores de sensibilidad del Etest (r) diferentes de los intervalos establecidos en el método de referencia, se aproximaron a la concentración inmediatamente superior empleada por el método del CLSI para facilitar su correcta interpretación categórica. Todos los antifúngicos empleados fueron suministrados por la casa comercial Sigma-Aldrich.

Interpretación de los datos y análisis estadístico

Para los tres antifúngicos, se consideraron sensibles las cepas con valores de CIM de 1 µg/ml o menores, con sensibilidad intermedia, aquellas con una CIM de 2 µg/ml, y como resistentes, aquellas con una CIM de 4 µg/ml o menos (10).

Los datos de concentración de la anfotericina B y el itraconazol se transformaron a escala para su análisis estadístico (transformación logarítmica). Se calcularon las medias geométricas de los tres antifúngicos para cada grupo según su origen, y para las especies A. fumigatus, A. flavus y A. niger frente a la anfotericina B y el itraconazol.

Se hizo un análisis de varianza (ANOVA) para comparar las medias de CIM de los dos antifúngicos en todas las especies evaluadas, y las medias de los valores de CIM de los grupos según el origen. También, se determinó la relación entre el grado de sensibilidad a los dos antifúngicos y el origen de las cepas mediante un test de χ2 de Fischer. El voriconazol se excluyó de los ANOVA dado que para este se utiliza un método de evaluación diferente al del CLSI. En todos los análisis se empleó un alfa de 0,05. Los datos se analizaron con el programa estadístico GraphPad Prism, versión 6.01.

Resultados

En el cuadro 1 se presentan todas las cepas evaluadas mediante el ensayo de microdilución frente a la anfotericina B y el itraconazol. Se evaluó una cepa de A. terreus, pero esta no se tuvo en cuenta en los análisis de varianza por no ser estadísticamente representativa.

Cuadro 1 Valores de concentración mínima inhibitoria (CIM) de la anfotericina B (AMB) y del itraconazol (ITZ) para las cepas evaluadas por el método de microdilución. Los grupos corresponden al origen de la cepa. G1: ambientes interiores y exteriores no hospitalarios; G2: ambiente hospitalario; G3: muestras clínicas.

La media geométrica de la CIM de la anfotericina B, en el G1, fue de 2,14 µg/ml, en el G2, de 1,80 µg/ml, y en el G3, de 1,19 µg/ml. La media geométrica de la CIM del itraconazol, en el G1, fue de 0,73 µg/ml, en el G2, de 0,52 µg/ml, y en el G3, de 0,13 µg/ml. Para A. fumigatus, la media geométrica de la CIM fue de 0,90 para la anfotericina B y de 0,26 para el itraconazol; para A.flavus , fue de 2,73 para la anfotericina B y de 0,22 para el itraconazol; y para A. niger, fue de 1,62 para la anfotericina B y de 0,84 para el itraconazol.

Se detectaron 21 cepas resistentes a la anfotericina B y tres cepas resistentes al itraconazol. En el G1, 7 (11,67 % del total) cepas mostraron valores de CIM para la anfotericina B correspondientes al criterio de resistencia; en el G2, se detectaron 8 (13,33 % del total) cepas y, en el G3, 6 (10 % del total). Solo se observaron tres (5 % del total) cepas resistentes al itraconazol en el G1. La especie con mayor número de cepas resistentes a la anfotericina B fue A. flavus (21,67 %), seguida por A. niger (6,67 %) y A. fumigatus (5 %). Aspergillus niger resultó ser la única especie (5 %) resistente al itraconazol.

En la figura 1 se presenta la distribución de las cepas según especie y patrón de sensibilidad. El ANOVA mostró diferencias significativas (p<0,05) en las medias de las muestras entre especies para los antifúngicos evaluados mediante microdilución (anfotericina B: p=0,0069; itraconazol: p=0,0016). El ANOVA no arrojó diferencias significativas (p<0,05) en las medias de las muestras entre los grupos frente a la anfotericina B (p=0,26), pero fue estadísticamente significativo frente al itraconazol (p=0,0001).


Figura 1 Distribución de las cepas evaluadas mediante el ensayo de microdilución (M38-A2) según la especie y el patrón de sensibilidad a la anfotericina B (AMB) (a) y al itraconazol (ITZ) (b)

En la figura 2 se presenta la distribución de las cepas según el patrón de sensibilidad y los grupos definidos según su origen. Mediante el test de χ2 de Fischer, se estableció la independencia entre las variables del grado de sensibilidad a la anfotericina B y el origen de las cepas. No se pudo hacer el test de χ2 para el itraconazol debido al tamaño de la muestra y a la ausencia de cepas en las categorías de la variable de grado de sensibilidad.


Figura 2 Distribución de las cepas evaluadas mediante el ensayo de microdilución (M38-A2) según su patrón de sensibilidad y el origen del aislamiento. a) frente a la anfotericina B (AMB); b) frente al itraconazol (ITZ). G1: ambientes interiores y exteriores no hospitalarios; G2: ambientes hospitalarios; G3: muestras clínicas

Los valores de la CIM del voriconazol se presentan en el cuadro 2. La media geométrica de la CIM para este antifúngico fue de 0,54 µg/ml en el G1, de 0,55 µg/ml en el G2, y de 0,14 µg/m en el G3. La cepa de A. terreus no se incluyó en el cálculo de esta media geométrica en el G3. No se hallaron cepas resistentes a este antifúngico.

Cuadro 2 Valores de concentración mínima inhibitoria (CIM) del voriconazol (VCZ) para las cepas evaluadas por Etest (r) . Los grupos corresponden al origen de las cepas. G1: ambientes interiores y exteriores no hospitalarios; G2: ambientes hospitalarios;

Discusión

En el estudio se evidenció un grado variable de reacción a la anfotericina B; sin embargo, en el análisis estadístico de la relación entre el origen ambiental de las cepas y sus patrones de sensibilidad a este antifúngico, no se pudo confirmar la hipótesis. Este polieno es el antifúngico de primera línea para el tratamiento de las micosis graves y su empleo está generalizado en la mayoría de los hospitales, lo cual supone una problemática cuya verdadera dimensión no se conoce, pues la presión selectiva en estos ambientes podría contribuir a la aparición de fenotipos resistentes (12).

Afortunadamente, la resistencia a este antifúngico es poco frecuente y posiblemente esté asociada a bajos niveles de ergosterol en la membrana celular, lo que conlleva una menor acción del fármaco (13), o a la presencia de mutaciones en el gen erg3 que originan la inactivación de la 5,6-esterol desaturasa, una enzima que participa en la ruta de biosíntesis del ergosterol y genera esteroles anormales cuando se ve afectada. Asimismo, existen especies de Aspergillus capaces de producir enzimas con actividad reductora, que disminuyen el efecto oxidativo de la anfotericina B en el metabolismo fúngico (14).

Aspergillus terreus es una especie que ha surgido como patógeno oportunista capaz de causar aspergilosis pulmonar, onicomicosis y queratomicosis, entre otras enfermedades, y ha suscitado especial atención por su resistencia natural in vitro e in vivo (15). En 2009, Lars-Flörl, et al. (16), evaluaron el comportamiento de 79 cepas de A. terreus frente a nueve agentes antifúngicos. La media geométrica de los valores de CIM obtenidos para la anfotericina B fue de 1,77 µg/ml (16). Aunque en el presente estudio solo se encontró una cepa perteneciente a esta especie, esta mostró la máxima CIM registrada para este antifúngico (>16 µg/ml), comparable con muchas de las cepas analizadas por Lars-Flörl, et al. Si se supera el número de aislamientos de esta especie, se podría confirmar con mayor certeza que su resistencia natural a la anfotericina B no es un fenotipo poco común.

La distribución de especies pudo influir en los datos de los grupos. El análisis de varianza confirmó la existencia de diferencias significativas entre los valores de CIM para las diferentes especies evaluadas (figura 1). En el estudio, el mayor número de cepas resistentes a la anfotericina B se concentró en A.flavus , con 21,67 % (13 cepas) del total, y esta fue la especie con la mayor media geométrica (2,73). Según Krishnan, et al., la resistencia a este antifúngico en A.flavus es frecuente (17), y Seo, et al., plantean que dicho fenómeno puede deberse a alteraciones en las concentraciones de beta1,3 glucano y de los complejos proteicos de la pared celular de esta especie, que disminuyen la interacción de la anfotericina B con la membrana plasmática (18).

Cuatro (6,67 %) cepas de A. niger y solo tres (5 %) cepas de A. fumigatus, fueron resistentes a la anfotericina B, resultados que coinciden con los de varios estudios (19-21).

En estudios sobre aeromicota en Cuba, se ha evidenciado que la especie A. flavus es la de mayor predominio entre las potencialmente patógenas (22,23). Infortunadamente, no se conoce con precisión la situación real de las infecciones causadas por Aspergillus spp. en nuestro país, lo que genera incertidumbre sobre la prevalencia de esta especie como causante de infección y el subsecuente problema terapéutico que puede generar.

Es importante tener en cuenta que el proceso de identificación de las especies se hizo mediante los métodos convencionales basados en el análisis de las características culturales y de la micromorfología. Esto constituye un sesgo para la clasificación taxonómica por las diferentes modificaciones que ha sufrido la sistemática de hongos en las últimas décadas con el apoyo de las técnicas de identificación molecular. Existe la posibilidad de que algunas de estas cepas pertenezcan a otras especies clasificadas en las diversas secciones establecidas para el género Aspergillus, las cuales son imposibles de determinar mediante la metodología convencional. Estas especies 'crípticas', como se denominan, tienen patrones de sensibilidad categorizados como resistentes a la mayoría de los antifúngicos empleados en el ámbito clínico (24) y podrían ser la causa de los perfiles de sensibilidad registrados en este trabajo.

Solo se encontraron tres cepas resistentes al itraconazol (>16 µg/ml) de la especie A. niger en el grupo de ambientes interiores y exteriores no hospitalarios. En diversos estudios a nivel internacional, se comenta sobre la resistencia de esta especie al antifúngico (15,25,26). Tokarzewski, et al., en un grupo de 10 cepas de A. niger, obtuvieron valores de CIM90 frente a este antifúngico de hasta 8 µg/ml mediante el método M38-A, y cinco cepas clasificadas como resistentes, según lo establecido por el CLSI (27). Asimismo, Gheith, et al., hallaron valores elevados (2 mg/l) de la CIM90 del itraconazol, en 17 cepas de A. niger aisladas de pacientes con enfermedades hematológicas en Túnez (21).

La evaluación del voriconazol no reveló cepas resistentes; sin embargo, una de ellas se clasificó como de sensibilidad intermedia, y ocho sensibles presentaron el valor extremo de su categoría. Los valores de la CIM del voriconazol fueron similares a los reportados por Pfaller, et al. (28). Este antifúngico actúa, no solo sobre la 14esterol demetilasa, enzima diana de la mayoría de los azoles, sino también, sobre la 24-metileno dihidro-lanosteroldemetilasa, otra enzima de la ruta biosintética del ergosterol (29), lo cual podría explicar su mejor efecto en comparación con otros antifúngicos de su misma familia farmacológica, y constituye otra prueba de su potencial terapéutico.

Uno de los nuevos grupos farmacológicos en el tratamiento de la aspergilosis es el de las equinocandinas, moléculas que actúan como inhibidores de la beta-1,3-D-glucano sintasa y afectan indirectamente la incorporación de los beta-1,3-Dglucanos a la pared celular de los hongos.

En el género Aspergillus, estos polisacáridos se concentran fundamentalmente en la pared de la región apical de la hifa y no en el resto del micelio y, por lo tanto, la actividad del fármaco influye sobre la velocidad del crecimiento fúngico, pero no sobre otros aspectos fisiológicos (30). La evaluación de la sensibilidad in vitro de estos antifúngicos es compleja debido al llamado efecto de arrastre (trailing effect) que impide establecer de forma precisa la CIM, por lo que en su lugar se utiliza la concentración efectiva mínima (CEM) como un concepto más adecuado para la interpretación de su actividad antifúngica (10,31).

Por falta de disponibilidad, en este trabajo no se pudieron evaluar la caspofungina, la anidulafungina ni la micafungina; sin embargo, existen diversos estudios a nivel internacional con interesantes resultados. En 2011, Lockhart, et al., publicaron un estudio en el que evaluaron la sensibilidad de 288 aislamientos de Aspergillus spp. a estas tres equinocandinas y ninguna de las CEM90 para A. fumigatus, A. flavus y A. niger sobrepasaron el valor de 0,06 µg/ml, en tanto que solamente A. terreus mostró un valor de 0,5 µg/ml para la caspofungina (32). En un estudio anterior, Messer,et al., también encontraron una buena actividad de la caspofungina y la anidulafungina frente a 49 aislamientos de A. fumigatus, con valores de CEM90 de 0,12 y 0,008 µg/ml, respectivamente (33).

En el presente estudio, no se comprobó la existencia de una relación entre el origen ambiental de las cepas y su patrón de sensibilidad al itraconazol (figura 2). Sin embargo, las cepas resistentes a este antifúngico se concentraron en el G1 (5 %) con la mayor media geométrica (0,84), un hecho interesante dado que son cepas que provienen de ambientes en los cuales los azoles no tienen uso clínico.

En países europeos y asiáticos, se ha observado que muchas de las cepas de A. fumigatus resistente a azoles son frecuentes en campos de cultivo o zonas donde el uso agrícola de triazoles es habitual, o en pacientes que nunca han sido tratados con antifúngicos pero tienen un vínculo estrecho con este tipo de ambientes. El tebuconazol, el propiconazol, el protioconazol, el tetraconazol, el metconazol y el epoxiconazol, son algunos de los fungicidas inhibidores de la desmetilación que a menudo se emplean para la protección contra agentes fitopatógenos (34).

Pham, et al., señalaron que estos compuestos tienen una naturaleza homóloga con los triazoles de uso clínico, y que los microorganismos están expuestos con mayor frecuencia a ellos, lo cual facilita que ocurran mutaciones y que estas se propaguen (4). En los estudios de Faria-Ramos, et al., se emplearon tres cepas de A. fumigatus sometidas a incrementos de procloraz, un azol usado ampliamente en la agricultura; posteriormente, analizaron su sensibilidad al itraconazol, el voriconazol, el posaconazol y el fluconazol, registrando un incremento en los valores de la CIM para los triazoles de uso clínico, lo cual aportó evidencias sobre este tipo de resistencia adquirida en el entorno natural (35).

En Cuba, se ha descrito la influencia de fenómenos meteorológicos en la diseminación de algunas especies de hongos. En 2006, Lopetegui, et al., propusieron modelos predictivos de la trayectoria de conidios transportados por los vientos de diferentes huracanes (36). Asimismo, en reportes meteorológicos anuales de la región del Caribe, se han registrado tormentas de polvo provenientes de la región del Sahara, entre los meses de marzo y agosto (37), casualmente, la época en la que se aislaron muchas de estas cepas. Estos datos sugieren la posibilidad de que los microorganismos no sean autóctonos y hayan sido importados de forma natural desde áreas con predominio de fenotipos resistentes, o que sean cepas recombinantes de genotipos endémicos con cepas foráneas resistentes.

Este estudio es una investigación preliminar sobre el comportamiento de los patrones de sensibilidad en cepas cubanas de las especies de Aspergillus de mayor interés clínico. Se encontró que la resistencia a los azoles era poco frecuente, lo cual es favorable desde el punto de vista epidemiológico y terapéutico. La resistencia a la anfotericina B, en cambio, fue considerable y ello constituye una alerta. Como parte de futuros proyectos, se pretende aumentar el tamaño de la muestra poblacional para confirmar con mayor precisión estos resultados.


Financiación Se obtuvo del Ministerio de Salud Pública de la República de Cuba.

Agradecimientos

A los doctores Edel García e Ileana Paneque, por sus contribuciones al desarrollo de este estudio.

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