NOTA TÉCNICA

Detección de Treponema pallidum subespecie pallidum para el diagnóstico de sífilis congénita mediante reacción en cadena de la polimerasa anidada

Detection of Treponema pallidum subspecies pallidum for the diagnosis of congenital syphilis by nested polymerase chain reaction

Gladys Pinilla1*; Lesly Campos1; Andrea Durán1; Jeannette Navarrete1; Liliana Muñoz1

1 Grupo de Investigación REMA, Facultad de Ciencias de la Salud, Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Bogotá, D.C., Colombia

* Correspondencia: Gladys Pinilla, Facultad de Ciencias de la Salud, Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, Calle 28 N° 5B-02, Bogotá, D.C., Colombia Teléfono: (571) 241 8800, extensión 281; fax: (571) 284 1717 y
Contribución de los autores:* Gladys Pinilla: planificación del proyecto, asesoría y seguimiento de la investigación Lesly Campos y Andrea Durán: revisión bibliográfica, pruebas moleculares y análisis de resultados Jeannette Navarrete y Liliana Muñoz: pruebas serológicas, análisis de resultados y seguimiento de la investigación Todas las autoras participaron en la escritura del manuscrito.
Conflicto de intereses* Los autores declaran no tener conflicto de intereses

Recibido: 2016 Diciembre 15; Aceptado: 2017 Marzo 27



Resumen

Introducción.

La sífilis es una enfermedad producida por Treponema pallidum subespecie pallidum cuya incidencia mundial es de 12 millones de casos por año, aproximadamente; de estos, más de dos millones se presentan en mujeres gestantes, siendo la sífilis congénita la complicación más grave de esta infección en el embarazo.

Objetivo.

Detectar la presencia de T. pallidum subespecie pallidum en muestras clínicas para el diagnóstico de sífilis congénita mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada y determinar su concordancia con las pruebas serológicas.

Materiales y métodos.

Mediante PCR convencional y anidada, se amplificaron tres genes diana (polA, 16S ADNr y TpN47) y se confirmaron los productos de amplificación de los genes TpN47 y polA por secuenciación. Las pruebas serológicas empleadas fueron la VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), la de reagina plasmática rápida (Rapid Plasma Reagin, RPR) y la de aglutinación de partículas para Treponema pallidum (Treponema pallidum Particle Agglutination Assay, TPPA).

Resultados.

La sensibilidad para la PCR convencional fue de 52 pg y, para la PCR anidada, de 0,52 pg. La especificidad con los iniciadores TpN47 y polA fue de 100 %; los resultados de la secuenciación mostraron una identidad de 97 % con T. pallidum. En 70 % de las muestras, los resultados de las pruebas serológicas y la PCR anidada concordaron.

Conclusión.

El gen TpN47 resultó ser el mejor blanco molecular para la identificación de T. pallidum. La PCR anidada se presenta como una alternativa de diagnóstico molecular promisoria para el diagnóstico de sífilis congénita.

Palabras clave: Treponema pallidum, sífilis congénita, reacción en cadena de la polimerasa, serología.


Abstract

Introduction.

Syphilis is a disease produced by Treponema pallidum subspecies pallidum, which affects approximately 12 million people worldwide every year. Of these, more than 2 million are pregnant women whose babies end up having congenital syphilis, the worst form of this infection.

Objective.

To detect the presence of T. pallidum subspecies pallidum in clinical samples in order to diagnose congenital syphilis by means of nested PCR, and to determine its concordance with serological testing.

Materials and methods.

Three target genes (polA, 16S ADNr y TpN47) were amplified by conventional and nested PCR. The results from the amplification of the TpN47 and polA genes were confirmed by sequencing. The serological tests used were VDRL (Venereal Disease Research Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin) y TPPA (Treponema pallidum Particle Agglutination Assay).

Results.

The sensitivity for the conventional PCR was 52 pg and 0.52 pg for the nested PCR. The specificity of primers TpN47 and polA was 100 %; the results of the sequencing showed a 97 % identity with T. pallidum. There was concordance between the serology and the nested PCR in 70% of the samples.

Conclusion.

The TpN47 gene was the best molecular target for the identification of T. pallidum. The nested PCR is a promising molecular tool for the diagnosis of congenital syphilis.

Key words: Treponema pallidum, syphilis, congenital, polymerase chain reaction, serology.

La sífilis es una infección de transmisión sexual causada por la espiroqueta Treponema pallidum subespecie pallidum1. Entre 0,5 y 1,0 millón de casos de sífilis congénita se producen en el mundo cada año y más de una quinta parte de los casos de mortalidad neonatal se atribuyen directamente a la sífilis en algunos países en desarrollo 2, en donde el 10 % de la población puede estar infectada 3.

Según reportes de Instituto Nacional de Salud, en la década del 2000 al 2010, la prevalencia de sífilis congénita en Colombia pasó de 1,3 a 2,5 por mil nacidos vivos, y la de la gestacional, de 1,3 a 5,4. Además, el subregistro de casos es elevado, por lo cual no se conoce la verdadera magnitud del problema 4. Solo en el litoral pacífico colombiano, se reportaron 141 casos de sífilis congénita en el 2010, y su incidencia a nivel nacional fue de 1,68, 1,04 y 0,55 en 2014, 2015 y 2016, respectivamente 5-7. La sífilis gestacional y la congénita se consideran un problema de salud pública, por lo cual se planteó un “Plan estratégico para la eliminación de la transmisión materno-infantil de VIH y de la sífilis congénita, 2011-2015”, así como una nueva guía de práctica clínica basada en la ‘evidencia’ 8-10.

Cuando la sífilis se presenta en el embarazo, se asocia con pronósticos devastadores en la mayoría de los casos, incluidos la pérdida temprana del feto, la muerte fetal, el parto prematuro, el bajo peso al nacer, la muerte neonatal e infantil y las enfermedades congénitas en los recién nacidos 2. La detección temprana es crucial para la prevención de estas complicaciones 11, pero hay dificultades en el diagnóstico debido a que, en los países en desarrollo, las mujeres embarazadas no siempre tienen acceso a los controles prenatales 11,12. Además, las técnicas serológicas no tienen especificidad suficiente para la detección de la enfermedad en los neonatos y su sensibilidad también es baja, por lo que se pueden presentar falsos positivos o falsos negativos, y los métodos diagnósticos no están ampliamente disponibles 1,2,13.

Treponema pallidum es una espiroqueta no cultivable en medios artificiales; por tal motivo, en el diagnóstico de laboratorio se utiliza la microscopía de campo oscuro o las pruebas serológicas, cuyos resultados pueden verse alterados por diversas situaciones propias del paciente o de la técnica. Asimismo, el diagnóstico de la sífilis congénita se complica debido a que 60 % de los niños infectados son asintomáticos al nacer, o presentan signos leves e inespecíficos 14.

Por otro lado, la detección molecular del microorganismo se ha implementado para el diagnóstico oportuno de la sífilis, la tipificación de las cepas y la evaluación de la resistencia antimicrobiana 15. Con la PCR se puede detectar el agente patógeno directamente, su tiempo de reacción es corto, su rendimiento es bueno y puede evitar falsos negativos en el diagnóstico de la sífilis; la técnica, además, puede hacerse en la mayoría de los laboratorios microbiológicos actuales 16.

La variante anidada de la PCR consiste en la amplificación de una parte del producto de una reacción realizada con anterioridad. La amplificación mediante PCR de una región del gen polA se ha utilizado preferentemente para la detección de casos sospechosos de sífilis 2, ya que su secuencia está muy conservada en los diversos organismos. También, se suele emplear el gen TpN47, el cual codifica una proteína integral de membrana y es inmunógeno dominante de T. pallidum17,18. El gen 16S ARNr, cuya ventaja es el gran número de copias por célula, también se ha utilizado para detectar especies bacterianas mediante PCR.

En este contexto, se vio la necesidad de seleccionar un gen blanco para el diagnóstico efectivo e implementar una técnica sensible y específica para la detección temprana de los neonatos y de las mujeres gestantes infectadas, con el fin de garantizar su tratamiento, así como el control y la vigilancia oportunos.

Materiales y métodos

Muestras infectadas en el laboratorio

Se inocularon 25, 50 y 100 μl de exudado de testículo de conejo infectado con T. pallidum en muestras negativas de sangre y tejido de cordón umbilical.

Muestras clínicas

Se procesaron 15 muestras de suero, siete de líquido cefalorraquídeo (LCR) de hijos y una de sangre de cordón umbilical, provenientes de madres e hijos con sospecha de sífilis gestacional y congénita. Como control positivo, se usó exudado de testículo de conejos infectados con la cepa de control Nichols de la bacteria T. pallidum subespecie pallidum (donada por el Departamento de Inmunopatología de la Sífilis, Universidad de Washington, Seattle, Estados Unidos). Como controles negativos, se usaron muestras de suero de pacientes que habían sido analizadas mediante pruebas treponémicas y no treponémicas, y cuyos resultados fueron negativos.

Extracción de ADN

En las muestras infectadas en el laboratorio, las muestras clínicas de suero, las de sangre de cordón y las de control, se aplicó un tratamiento previo con proteinasa K (2 mg/ml) a 65 °C durante una hora con una solución tampón de lisis celular o nuclear, según el caso, y se siguieron las indicaciones del estuche Genomic DNA Purification® (Promega) 19,20. Las muestras de líquido cefalorraquídeo se trataron con proteinasa K (4 mg/ml) y se incubaron durante 20 minutos a 65 °C, utilizando el protocolo de extracción del estuche QIAamp DNA Minikit® (QIAGEN) 21.

PCR convencional

Se amplificaron las secuencias de los genes polA, 16S ADNr y TpN47 de T. pallidum subespecie pallidum, a partir de ADN de control positivo utilizando los iniciadores diseñados y las condiciones previamente descritas por Pinilla, et al. 20.

PCR anidada

Los productos de amplificación obtenidos por PCR convencional, se amplificaron nuevamente mediante una segunda pareja de iniciadores internos (polA-2, 16S-2 y TpN47-2) descritos previamente 20. Se tomó 1 μl del producto de amplificación de la PCR convencional.

Ensayo de sensibilidad y especificidad

Se hicieron 10 diluciones seriadas en base 10 del ADN de control positivo (2,6 ng/μl) y, para determinar la especificidad, se usó ADN de Salmonella enteritidis, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y ADN humano extraído de sangre de pacientes sanos.

Muestras infectadas en el laboratorio y muestras clínicas

Se seleccionaron las secuencias de los genes TpN47 y polA por ser los más específicos y se amplificaron mediante PCR anidada a partir de muestras de sangre y tejido de cordón umbilical infectadas en el laboratorio. En las muestras clínicas, se amplificó el gen TpN47 por ser el blanco molecular que mostró mejores resultados en las pruebas preliminares.

Secuenciación

Se llevó a cabo la secuenciación del amplicón de los genes polA (200 pb) y TpN47 (135 pb) (22), y con las herramientas Blast y Chromas, se analizaron las secuencias obtenidas.

Pruebas serológicas

Se utilizaron las pruebas TPPA (treponémica) y VDRL y RPR (no treponémicas), para las muestras de suero de madres y neonatos, y de líquido cefalorraquídeo de neonatos 23-25.

Resultados

Sensibilidad de la PCR convencional y la PCR anidada

Con la PCR convencional se obtuvo una sensibilidad de 52 pg, usando como gen blanco el TpN47, en tanto que, con la PCR anidada, se alcanzó una sensibilidad de 0,52 pg, es decir, la sensibilidad aumentó 100 veces con este último en comparación con el primero.

El gen 16S ADNr se comportó de forma similar, con un aumento de 1.000 veces en la sensibilidad al amplificar de nuevo el producto.

El gen polA mostró ser el blanco con menor sensibilidad, pues permitió identificar 52 pg de ADN en la PCR anidada (cuadro 1).

Cuadro 1 Sensibilidad de los blancos moleculares en la PCR anidada

Especificidad

Se encontró una especificidad de 100 % en los iniciadores TpN47 y polA, ya que no hubo amplificación de ninguna cadena de molde de ADN bacteriano o humano. Por el contrario, los iniciadores de 16S ADNr demostraron ser inespecíficos al usar como cadena de molde de las reacciones el ADN de E. aerogenes y P. mirabilis, por lo cual registraron una especificidad de 60 %; estos hallazgos solo se hicieron evidentes en la segunda ronda de amplificación.

Muestras infectadas en el laboratorio

Se logró la amplificación de las muestras experimentalmente infectadas en el laboratorio usando el gen TpN47; los amplicones fueron observables desde la primera amplificación. Sin embargo, en muestras clínicas es importante hacer la PCR anidada, ya que la muestra clínica 01 de líquido cefalorraquídeo solo fue positiva a partir de la segunda ronda de amplificación, en tanto que, al usar el gen polA como blanco molecular, solo dos muestras experimentalmente infectadas en el laboratorio amplificaron y fueron positivas en la segunda ronda de PCR (figura 1).


Figura 1 Electroforesis en gel de agarosa de productos de amplificación de la PCR anidada usando los genes TpN47 (A) y polA (B) Parte superior: productos de la primera PCR con los iniciadores TpN47-1 (A) y polA-1 (B). Parte inferior: productos de la PCR anidada con los iniciadores TpN47-2 (A) y polA-2 (B). Carril 1: marcador de peso molecular de 100 pb. Carril 2: control negativo. Carriles 3 a 7: muestras experimentalmente infectadas. Carril 8: muestra clínica de líquido cefalorraquídeo de neonato número 01. Carril 10: muestra clínica de líquido cefalorraquídeo de neonato número 03. Carril 11: muestra clínica de suero de neonato. Carril 12: control positivo, ADN de T. pallidum

Concordancia entre las pruebas serológicas y las pruebas moleculares

Se procesaron 23 muestras clínicas mediante PCR anidada y, en 20 de ellas, se hicieron también las pruebas serológicas. En 14 de las muestras se obtuvieron resultados concordantes con los dos tipos de pruebas (70 %): 11 de ellas correspondían a muestras clínicas con resultados positivos con ambas técnicas (55 %) y en tres los resultados fueron negativos (15 %) (cuadro 2).

Cuadro 2 Concordancia entre los resultados obtenidos mediante la PCR anidada y las pruebas serológicas, según el tipo de muestra

Se evidenció una concordancia de 42,8 % entre las pruebas moleculares y la prueba de TPPA en seis de las 14 muestras analizadas, y hubo resultados discrepantes en seis de las muestras (30 %) procesadas con las dos técnicas: una (5 %) muestra fue positiva en la PCR anidada y negativa en las pruebas serológicas, y cinco (25 %) muestras fueron positivas en la serología y negativas en la PCR anidada. Se obtuvieron resultados positivos en 16 (80 %) muestras con serología y en 12 (60 %) con la PCR anidada (cuadro 3).

Cuadro 3 Muestras con resultados discrepantes en la PCR anidada y en las pruebas serológicos
* Total de muestras procesadas mediante PCR anidada y pruebas serológicas

Secuenciación

Se obtuvo una identidad de 97 % con las secuencias de la base de datos Blast de T. pallidum subespecie pallidum, lo cual confirmó que, en las reacciones de PCR anidada, se amplificaron efectivamente los genes TpN47 y polA del microorganismo; así, se ratificó la confiabilidad de la amplificación del ADN de la espiroqueta en las muestras clínicas.

Discusión

Una de las enfermedades más antiguas conocidas es la sífilis, la cual sigue causando una gran morbimortalidad perinatal 4,26, situación que requiere una intervención para alcanzar los objetivos de los planes de salud reproductiva a nivel nacional y mundial 27.

Para determinar los genes de T. pallidum subespecie pallidum, se han empleado diversos métodos de PCR. En este estudio se emplearon la PCR convencional y la PCR anidada en los genes polA, TpN47 y 16S ADNr, para identificar el microorganismo.

La PCR y sus variantes, la PCR anidada, la PCR de transcripción inversa y la PCR cuantitativa, se han utilizado para amplificar, entre otros, los genes BMP, TpN47, TMPA y 4D (1), los cuales codifican para proteínas de superficie. Asimismo, se ha usado el gen polA, involucrado en la duplicación del genoma, y los genes 16S ADNr y 23S ADNr, que codifican el ARN ribosómico de T. pallidum2,16,17,28-30.

El gen TpN47 codifica la lipoproteína de 47 kDa y es uno de los objetivos más comúnmente reportados en PCR. Algunos autores plantean la hipótesis de que la proteína puede estar implicada en la síntesis de la pared celular y sería de esperar que este antígeno se conserve en espiroquetas relacionadas. Sin embargo, su función exacta no está clara, por lo cual la optimización de los cebadores es difícil debido a que las secuencias homólogas no están disponibles para la comparación 31.

El gen polA, que codifica para la polimerasa I de ADN de Treponema, se ha estudiado ampliamente debido a la poca homología de la enzima con las ADN polimerasas I de otros microorganismos, y a dos de sus características distintivas: la presencia de una región que codifica un gran contenido de cisteína y la presencia de cuatro inserciones únicas en el gen 20. Este gen se ha utilizado ampliamente en la fase preliminar de subtipificación molecular, análisis muy relevante, ya que permite conocer la diversidad de subtipos circulantes y determinar los cambios en la prevalencia de las cepas a lo largo del tiempo 32,33. El gen de la polimerasa se ha usado preferentemente para detectar casos sospechosos de sífilis 2.

En otros estudios, se ha planteado que la amplificación del gen 16S ADNr requiere una etapa de transferencia con el método de Southern para garantizar la especificidad, debido a la estrecha relación entre las secuencias del 16S ADNr de las especies 31.

En un estudio piloto, Pinilla, et al., determinaron que, mediante la amplificación de una región de 203 pb del 16S ADNr de T. pallidum subespecie pallidum, detectada mediante PCR convencional, la sensibilidad fue diez veces menor que la obtenida con el gen polA (3,28 ng) para la detección del ADN de la espiroqueta 20. En cuanto a la sensibilidad reportada para los genes 16S ADNr y polA, se observó un aumento de la sensibilidad con cada gen al hacer una segunda etapa de amplificación; sin embargo, se evidenció mayor sensibilidad con el gen 16S ADNr que con el polA, lo cual se asoció al mayor número de copias, las cuales varían de una hasta 15 por genoma. También, se ha registrado la variación en el número de copias de ADNr entre cepas de la misma especie, lo que, en algunos taxones, se correlaciona con su capacidad para reaccionar a condiciones desfavorables de crecimiento 34.

Con el empleo del gen TpN47 en una PCR anidada, se ha llegado a una sensibilidad del orden de 0,032 pg 21, lo que concuerda con los resultados obtenidos en este estudio, ya que se alcanzaron los 0,52 pg amplificando el mismo gen.

La diferencia en la sensibilidad de la amplificación de los genes también se relacionaría con el hecho de que la eficacia de amplificación de la PCR probablemente refleja la longitud del producto, lo cual indicaría que los fragmentos más pequeños se amplifican con mayor facilidad 35.

En el presente estudio, al amplificar el gen diana TpN47 de T. pallidum, se obtuvo una especificidad de 100 % en las dos etapas de amplificación de la PCR anidada. En otros estudios se han obtenido resultados similares, por ejemplo, Grange, et al., encontraron que la especificidad en la detección del genoma de T. pallidum fue alta (92-97 %) al usar como gen diana de amplificación el TpN471.

El ADN de T. pallidum se puede detectar en muestras clínicas de suero, sangre completa, líquido amniótico, tejido placentario embebido en parafina, lesiones cutáneas ampollosas y líquido cefalorraquídeo de niños con sífilis congénita. La detección del ADN en sangre completa y suero en estos pacientes parece ser más confiable que en los pacientes adultos, probablemente debido a la concentración relativamente alta de treponemas en la sangre de los primeros 3.

Liu H, et al., reportaron el éxito de la PCR para detectar T. pallidum en muestras clínicas de sangre completa, fracciones de sangre, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo y úlceras del aparato genitourinario 31. La conservación de las muestras también puede afectar los resultados de la PCR; en este sentido, Buffet, et al., encontraron que aquellas muestras de tejido congeladas inmediatamente antes del análisis conservaron el ADN intacto, lo que podría explicar una mejor sensibilidad en los hallazgos 3.

En el presente estudio, se logró amplificar el ADN de T. pallidum en tres tipos de muestra: suero, líquido cefalorraquídeo y sangre de cordón. Además, para obtener resultados óptimos, es necesario utilizar diferentes métodos de conservación y de preparación, según el tipo de muestra 17.

Al comparar los resultados de la PCR con los de las pruebas de serología (VDRL y RPR), Orle, et al., obtuvieron una concordancia de 88 % utilizando una PCR múltiple para la identificación del TPN47 en los 296 pacientes estudiados (30). En el 2001, Bruisten, et al., identificaron el gen bmp de T. pallidum y compararon los resultados con los ensayos serológicos TPHA, RPR y FTA-Abs en 364 pacientes mediante una PCR múltiple anidada y encontraron que solo en cuatro pacientes hubo resultados positivos con las pruebas de serología, nueve fueron positivos en la PCR y tres lo fueron tanto en las pruebas de serología como en la PCR, con una concordancia de 96 % 36.

En el presente estudio, se obtuvo una concordancia del 70 % en 20 muestras analizadas mediante PCR anidada y pruebas serológicas (VDRL, RPR y TPPA); de estas 20, 11 (55 %) eran muestras clínicas con resultados positivos en ambas técnicas y tres (15 %) eran negativas.

Por su parte, Leslie, et al., encontraron una concordancia de 95 % entre la PCR en tiempo real y las pruebas serológicas RPR, TPPA y EIA; en 14 de 301 pacientes, los resultados de la PCR en tiempo real (positivos) discreparon de los obtenidos mediante serología (negativos) y, en todos los pacientes, el umbral de detección presentó valores cercanos al límite 37.

En el presente estudio, también se registraron resultados discordantes en seis (30 %) muestras procesadas mediante las dos técnicas: una (5 %) muestra fue positiva con la PCR anidada y negativa con serología, y cinco (25 %) fueron positivas en la serología y negativas en la PCR anidada, lo cual podría explicarse por la detección de niveles bajos de T. pallidum o por representar resultados falsos positivos debido a la contaminación del ensayo de bajo nivel.

Por otra parte, la explicación más probable para el hallazgo de pacientes negativos en la PCR pero positivos en la serología, sería que el tiempo o el sitio de muestreo no fueron los adecuados 38, como se evidenció en el estudio de Casal, et al. 2, quienes plantearon que, en los estudios que utilizan diferentes genes diana y diversos métodos serológicos, se logra una buena correlación entre la PCR y las pruebas serológicas (entre 88 y 96 %).

La disminución del porcentaje de concordancia en el presente estudio sugeriría que los pacientes tenían una infección reciente, aunque no se excluyen las posibilidades de una reacción serológica inespecífica, un título bajo de anticuerpos o una concentración de ADN indetectable mediante la PCR 2.

Al comparar los resultados de la PCR convencional y de la PCR anidada, se evidenció que el número de muestras positivas aumentó considerablemente con esta última, lo cual evidencia que este método efectivamente aumentó la sensibilidad en la detección, pues se obtuvo un mayor número de copias del fragmento amplificado. Sin embargo, no se debe obviar el hecho de que una de las desventajas de esta PCR con respecto a la convencional, es que requiere más tiempo y materiales, y que el riesgo de contaminación es mayor, lo cual se puede evitar siguiendo las normas preventivas de contaminación para la PCR 37,39.

Por último, se puede concluir que el gen TpN47 es un blanco molecular prometedor y que la técnica propuesta es una alternativa diagnóstica y una herramienta valiosa que puede contribuir al control de la sífilis materna, y al diagnóstico y la vigilancia epidemiológica de la sífilis congénita. Asimismo, puede afirmarse que, si bien con la PCR cuantitativa podría lograrse una mejor sensibilidad, su uso requiere equipos más costosos y sofisticados, así como personal de laboratorio más especializado, por lo cual se restringiría a los laboratorios de referencia.

La implementación a corto plazo de la PCR anidada en los laboratorios clínicos especializados y a mediano plazo en los laboratorios de rutina en países en desarrollo, permitiría la detección temprana de la infección en neonatos y en mujeres gestantes infectadas para garantizar un tratamiento oportuno.


Financiación Los recursos para la realización de este proyecto fueron suministrados por la Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca, por medio de la Convocatoria Interna de Investigaciones 2016-2017.

Agradecimientos

A Yolanda Cifuentes de la Universidad Nacional de Colombia, a los hospitales de tercer nivel de Bogotá y al Hemocentro Distrital, por su contribución en el muestreo realizado. Al Departamento de Inmunopatología de la Sífilis de la Universidad de Washington, Seattle, EE.UU., por suministrar el control positivo para los ensayos.

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